Blastulae Gelişmekte Cerrahi Fusion tarafından Parabiyotik balığı Embriyolar Üretimi
Summary
This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.
Abstract
farklı genetik geçmişleri iki hayvan cerrahi parabiyoz hücre içsel farklı genetik ortamlarda aday ilgi genlerin, hücrelerin göç davranışları ve salgılanan sinyaller için hücre dış roller karşı çalışmak için benzersiz bir senaryo oluşturur. Parabiyotik hayvanlar ortak bir dolaşım paylaştığından, bir hayvandan herhangi bir kan ya da kan yoluyla bulaşan faktör ortağı ve tersi geçerli olacak. Bu nedenle, tek bir genetik geçmişe türetilmiş hücreler ve moleküler faktörler ikinci bir genetik arka bağlamında incelenebilir. Yetişkin farelerin parabiyoz araştırma yaşlanmanın, kanser, diyabet, obezite ve beyin gelişimi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Daha yakın zamanda, zebra balığı embriyoların parabiyoz hematopoez gelişim biyolojisi okumak için kullanılmıştır. Farelerde tersine, zebra balığı embriyolarının şeffaf doğası f araştırmak için benzersiz bir güçlü bir yöntem yapım Parabiyotik bağlamda hücrelerinin doğrudan görselleştirme izin verirundamental hücresel ve moleküler mekanizmalar. Bu tekniğin programı Ancak Parabiyotik zebrabalıkları embriyolar oluşturmak için bir öğrenme eğrisi ile sınırlıdır. Bu protokol ilgi aday genlerin rolünü araştırmak için farklı genetik geçmişleri iki zebra balığı embriyolarının blastulae sigorta cerrahi için nasıl bir adım-adım bir yöntem sağlar. Buna ek olarak, Parabiyotik zebrafish embriyolar olası gen ifadesinin zamansal kontrolü yapmak, ısı şok hoşgörülü. Bu yöntem sofistike bir set-up gerektirir ve embriyonik gelişim sırasında in vivo hücre göçü, kader özellikleri ve farklılaşma çalışmak için geniş uygulamalar mevcut değil.
Introduction
Yabani tip ve genetik olarak değiştirilmiş hayvanların arasındaki genetik mozaikler (şimerleri) oluşturulması hücre içsel aday genlerin 1-6 hücre-dışsal fonksiyonlar karşı araştırılması için köklü ve klasik bir stratejidir. Zebrabalıkları Blastula nakli yaygın hücre özerklik 7-9 çalışmaları için kimerik embriyolar oluşturmak için kullanılmıştır. Ilgi konusu doku bağlı olarak, ancak, tahmin edilebileceği gibi istenen dokuya (örneğin, kan) 1-3, 7-9 verici hedef hücrelere zor olabilir. Fare genetikçiler uzun bir ortak dolaşımı 10-14 ile yapışık organizmaları üretmek için Parabiyotik cerrahi yöntemler kullanmışlardır. Parabiyotik hayvanlar ortak kan dolaşımına paylaştığından, farklı genetik arka plan diğer hayvan hücreleri, bir hayvanda kökenli hücreler arasındaki etkileşimleri 10-16 incelenebilir. Son zamanlarda, Karima Kissa grubu zarif CRE yeteneğini gösterdiyapışık zebrafish embriyolar yedik ve daha sonra hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) göç 15 incelemek için bu sistemi kullanabilirsiniz. Buna ek olarak, Zebra balığı parabiyoz son zamanlarda hematopoetik kök hücre (HSC) ortaya çıkması ve göç, 16 endotelyal kaderin 5 rolünü araştırmak için ve zebra balığı gelişim 17 sırasında HSPC niş içinde stromal hücrelerin rolünü araştırmak için kullanıldı.
Farelerde aksine, Zebra balığı embriyolar şeffaf ve sistem benzersiz güçlü hale Parabiyotik gelişimi sırasında hücrelerin doğrudan görselleştirme için izin verir. Zebra balığı parabiyoz yarar, ancak ayrıntılı talimat ve görsel gösteri olmadan teknik olarak zor olabilir hassas embriyolar üzerinde dik bir öğrenme eğrisi ve Parabiyotik cerrahi ile sınırlıdır. Bu protokolün amacı, eğitim için Parabiyotik zebrafish embriyolar oluşturmak için nasıl video tabanlı öğreticiler eşlik net, adım adım talimatlar bir dizi sağlamaktırTemporal, hücreye özgü veya blastulae geliştirme cerrahi füzyonu ile aday gen (ler), hücre-dışsal fonksiyonlar. Anahtar değişiklikler ve artan parabiont hayatta kalma ve yeni deneysel uygulamalar için ek öneriler yer almaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parabiyotik füzyon yetişkin fare modelleri ve civciv embriyolarının 10-14 aday genlerin hücresel fonksiyonları araştırmak için güçlü bir araç olmuştur. Daha yakın bir zamanda Blastula füzyon metodu yapışık zebrabalıkları embriyolar 15 üretilmesi için tarif edilmiştir. Mevcut protokolde, video tabanlı öğreticiler göstermek ve daha iyi hematopoetik gelişiminde ilgi aday genlerin, zamansal hücre içsel ve dışsal hücre rollerini incelemek amacıyla farklı genetik köke…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley’s Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 |
| Name | Company | Catalog Number |
| Antibiotics: | ||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A |
| 10 mL pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 |
| PTU. working stock is 0.003% (50X is 0.15%). for 500ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | ||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
Riferimenti
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
