Summary
Her præsenteres en optimeret protokol til optælle og karakterisering af rhesus makak CD8 + T-celler mod AIDS-virus. Denne artikel er ikke kun nyttig til området for HIV immunologi, men også til andre områder af biomedicinsk forskning, hvor CD8 + T-cellereaktioner er kendt for at påvirke udfaldet sygdom.
Abstract
Peptid-dominerende histokompatibilitetskompleks klasse I (pMHC-I) tetramerer har været et uvurderligt værktøj til at studere CD8 + T-cellereaktioner. Fordi disse reagenser direkte binde til T-celle-receptorer på overfladen af CD8 + T-lymfocytter, fluorochrommærkede pMHC-I tetramerer muliggøre nøjagtig påvisning af antigen (Ag) -specifik CD8 + T-celler uden behov for in vitro-re -stimulation. Desuden, når kombineret med flerfarvede flowcytometri, kan pMHC-I tetramerfarvning afsløre vigtige aspekter af Ag-specifikke CD8 + T-celler, herunder differentiering fase, hukommelse fænotype, og aktiveringsstatus. Disse typer af analyser har været særligt anvendelige inden for HIV immunologi, hvor CD8 + T-celler kan påvirke progression til AIDS. Eksperimentel infektion af rhesus-makakaber med abeimmundefektvirus (SIV) tilvejebringer et uvurderligt værktøj til at studere cellulær immunitet mod AIDS-virus. Som følge heraf betydelig PROGREss er gjort med at definere og karakterisere T-celle responser i denne dyremodel. Vi præsenterer her en optimeret protokol for optælling SIV-specifikke CD8 + T-celler i makakaber efter pMHC-I tetramerfarvning. Vores assay tillader den samtidige kvantificering og hukommelse fænotypebestemmelse af to pMHC-I tetramer + CD8 + T-cellepopulationer pr test, som kan være nyttig til at spore SIV-specifikke CD8 + T-celle-responser frembragt af vaccination eller SIV-infektion. I betragtning af relevansen af ikke-humane primater inden for biomedicinsk forskning, denne metode kan anvendes til at studere CD8 + T-celle responser i flere indstillinger sygdom.
Introduction
CD8 + T-celler omfatter en afgørende komponent i det adaptive immunsystem, som de deltager i tumor immun overvågning og bidrage til udryddelse af intracellulære patogener 1. I enkle vendinger, CD8 + T-celler udtrykker T-cellereceptorer (TCR'er), som specifikt genkender peptid-dominerende histokompatibilitetskompleks klasse I (pMHC-I) molekyler til stede på plasmamembranen af værtscellerne. Da disse peptider er afledt af proteolyse af endogent syntetiserede proteiner, celleoverflade pMHC-I-komplekser give et vindue ind i intracellulære miljø. Ved virusinfektion, for eksempel, vil inficerede celler udviser MHC-I-molekyler, der indeholder virus-afledte peptider, der kan tjene som ligander for TCR udtrykt af patruljerer CD8 + T-celler. I tilfælde en virus-specifikke CD8 + T-celle møder en inficeret celle præsenterer sin pMHC-I-ligand, vil TCR engagement resultere i CD8-aktivering + T-celle og Ultiende føre til at målrette cellelyse. I betragtning af den kritiske karakter af disse TCR / pMHC-I-interaktioner, bestemmelse af størrelsen, specificitet og fænotype for at reagere CD8 + -T-celler kan ofte afsløre vigtige fingerpeg om humane sygdomme.
Indtil begyndelsen af 1990'erne, kvantificering af Ag-specifikke CD8 + T-celler har påberåbt sig den teknisk krævende begrænsende fortynding assay (LDA) 2,3. Ikke kun gjorde LDA kræve flere dage at være afsluttet, er det heller ikke at opdage celler, der manglede proliferative potentiale. Som et resultat heraf LDA voldsomt undervurderet den faktiske frekvens af antigen (Ag) -specifikke CD8 + -T-celler, der deltager i en immunreaktion. Selv om udviklingen af ELISPOT og intracellulære cytokin farvende assays stærkt forbedret evnen til at måle cellulær immunitet, disse metoder stadig påkrævet in vitro-stimulering til kvantificering Ag-specifikke T-celler 4. Det var ikke før 1996, at Altman, Davis, og colleagues offentliggjort deres skelsættende artikel rapporterer udviklingen af pMHC-I tetramer teknologi 5. Afgørende for succes af denne teknik var den multimerisering af pMHC-I-molekyler, der forlængede halveringstiden af TCR / pMHC-I-interaktioner, og derved reducere sandsynligheden for pMHC-I tetramerer falde ned under vaske- trinnene flowcytometriske assays. Den største fordel ved pMHC-I tetramerer forhold til de ovennævnte assays er evnen til nøjagtigt at detektere Ag-specifikke CD8 + T-celler direkte ex vivo uden behov for in vitro restimulering. Desuden er en kombination af pMHC-I tetramerfarvning med flerfarvede flowcytometri har tilladt detaljerede analyser af differentieringstrinet, hukommelse fænotype, og aktiveringsstatus af Ag-specifikke CD8 + T-celler 2-4. I lyset af de seneste tekniske fremskridt til karakterisering CD8 + T-celle repertoirer af pMHC-I multimer farvning 6, bredden af applikationer for denne metode vil sandsynligvis fortsætte med at udvide.
Kun få områder i biomedicinsk forskning har nydt mere fra pMHC-I tetramerfarvning end inden for HIV immunologi 7. Selvom CD8 + T-celler var blevet tidsmæssigt tilknyttet det oprindelige kontrol af HIV viræmi på tidspunktet for offentliggørelsen af Altman, Davis, og kolleger 8,9, brug af pMHC-I tetramerer i de følgende år væsentligt udvidet vores forståelse af HIV-specifikke CD8 + T-celle-respons. For eksempel pMHC-I tetramerfarvning bidrage til at bekræfte den robuste størrelse virus-specifikke CD8 + T-celle-responser i de fleste HIV-inficerede individer 10-12. Denne metode lettede også karakteriseringen af HIV og SIV-specifikke CD8 + T-celle-responser begrænset af MHC-I-molekyler associeret med spontan kontrol af viral replikation i fravær af antiretroviral behandling-et fænomen kendt som "elite kontrol"
Eksperimentel SIV-infektion af rhesus makakaber (Macaca mulatta) er fortsat den bedste dyremodel for at evaluere immune indgreb mod hiv / aids 18,19. I de seneste 25 år er der sket betydelige fremskridt i identifikation og karakterisering af SIV-specifikke CD8 + T-celler i denne abearter, herunder opdagelsen af MHC-I alleler og definitionen af peptid bindende motiver 13,20-27 . Som følge heraf har pMHC-I tetramerer blevet udviklet til analyse af SIV-specifikke CD8 + T-cellereaktioner i denne dyremodel 28. De fleste af disse reagenser er lavet af genprodukterne af fire rhesus makak MHC-I-alleler: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, og Mamu-B * 017: 01. Notatet gør rhesus makakaber ikke udtrykke en MHC-C locus 29. Langt størstedelen af de pMHC-I tetramerer anvendt i de foreliggende eksperimenter blev produceret hos NIH Tetramer Core Facility fra Emory University. Ikke desto mindre er nogle af disse reagenser, herunder Mamu-A1 * 001 tetramerer bundet til immundominerende Gag CM9 epitop, kan kun opnås fra kommercielle kilder på grund af licensaftaler. Brug af pMHC-I tetramerer af de fire rhesus macaque alleler anført ovenfor, har vi med succes opregnet CD8 + T-celler mod i alt 21 SIV epitoper (tabel 1), som blev induceret ved vaccination eller primær SIV infektion 30,31 (Martins et al., upublicerede observationer).
Den foreliggende manuskript tilvejebringer enoptimeret pMHC-I tetramerfarvning protokol til bestemmelse af frekvensen og hukommelse fænotypen af SIV-specifikke CD8 + T-celler i makakaber. Assayet begynder med en elektiv 30 minutters inkubation med et protein kinase inhibitor (PKI, her er Dasatinib anvendt) for at reducere TCR-internalisering og derved forbedre pMHC-I tetramerfarvning 32. Som beskrevet nedenfor, denne behandling er især nyttig, når du bruger Mamu-B * 017: 01 tetramerer. Instruktioner om, hvordan til at mærke cellerne med fluorokromkonjugerede pMHC-I tetramerer og monoklonale antistoffer (MAB) findes også. Denne protokol omfatter også en celle permeabilisering trin for den intracellulære detektion af cytolyse-associerede molekyle granzym B (Gzm B). MAb mod CD3 tilsættes ved dette trin, samt at forbedre påvisningen af denne TCR signalmolekyle. Som reference er alle fluorochromer anvendes i denne farvning panel angivet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De perifere mononukleære blodceller (PBMC) prøver anvendt i dette manuskript blev opnået fra indiske makakaber huses på Wisconsin National Primate Research Center. Disse dyr blev passet i overensstemmelse med Weatherall rapporten under en protokol godkendt af University of Wisconsin Graduate School Animal Care og brug Udvalg 33. Alle dyreforsøg blev udført under anæstesi og blev gjort alt for at minimere potentiel lidelse.
1. PKI Behandling
BEMÆRK: Dette er valgfrit, men anbefales til Mamu-B * 017: 01 tetramerer. Se Resultater og Diskussion Sektioner.
- Resuspender PBMC i R10-medium ved en koncentration på 1,6 x 10 7 celler / ml.
- Der tilsættes 50 pi af denne cellesuspension til den tilsvarende flowcytometri rør. Der tilsættes 50 pi af en 100 nM opløsning af PKI til hvert rør.
- Vortex hvert rør. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Ved udgangen af detteskridt bør hvert rør har 100 pi af en celle suspension indeholdende 8,0 x 10 5 PBMC og 50 nM PKI.
- Fortsætte til pMHC-I tetramerfarvning trin.
2. Farvning med fluorochrommærkede pMHC-I-tetramerer
- Før fremstilling af pMHC-I tetramer mastermix, centrifuger pMHC-I tetramer rør ved 20.000 xg i mindst 15 minutter ved 4 ° C. Målet med dette trin er at pelletere proteinaggregater i pMHC-I tetramer løsning, der kan øge baggrundsfarvning. Når centrifugeringen er færdig, undgå pipettering fra bunden af røret, hvor proteinaggregater vil have akkumuleret.
- Forbered nok pMHC-I tetramer mester mix til at farve alle eksperimentelle rør. Forbered et overskud på 15% af det samlede volumen af denne master mix til konto til pipettering fejl.
- Fortynd pMHC-I-tetramerer i pletten buffer (f.eks Brilliant Stain Buffer), således at 25 pi af pMHC-I tetramer mester mix er Added til hver test.
- Label PBMC med to pMHC-I tetramerer pr test; én konjugeret til allophycocyanin (APC) og den anden til Brilliant Violet (BV) 421.
- Tilføj 8,0 x 10 5 PBMC til den tilsvarende flowcytometri rør i et slutvolumen på 100 pi. Hvis cellerne blev underkastet den PKI behandling ovenfor beskrevne, bør de allerede resuspenderes i 100 pi på dette trin.
- Tilsæt 25 pi pMHC-I tetramer mastermix til den tilsvarende flowcytometri rør. Ved udgangen af dette trin, bør det endelige volumen i hvert rør være 125 pi.
- Vortex hvert rør for at homogenisere den celle suspension.
- Der inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 45 min. Forbered overfladen farvning mAb cocktail under denne 45 minutters inkubation.
3. Overflade Farvning
- Forbered nok mAb mester mix til at farve alle eksperimentelle rør. Forbered et overskud af 15% af det samlede volumen af denne master mix til regnskabtil pipettering fejl.
- Juster lydstyrken af master mix med plet buffer, således at der tilsættes 50 ul per test.
- For korrekt udelukkelse af ikke-CD8 + T-celler og afgrænsning af hukommelse delmængder, brug titreret mængder af mAb'er rettet mod følgende molekyler i overfladen farvning mastermix.
BEMÆRK: fluorokromer konjugeret til hver mAbs leveres som reference: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8a BV 785, CD28 PE Cy7, og CCR7 FITC. Bemærk, at mAb'erne mod CD14, CD16, og CD20 er konjugeret til det samme fluorochrom (dvs. BV 510), da de vil blive medtaget i "dumpe" gate. - Medtag en fixable farvestof til at skelne døde celler i overfladen farvning mester mix [dvs. amin reaktivt farvestof (ARD)]. Sørg for, at ARD reagens konjugeret til et fluorokrom med et lignende emission spektrum som dem, der anvendes i "dumpe" gate. I dette tilfælde skal du bruge ARD Aqua.
- Der tilsættes 50 pifarvningen mastermix beskrevet i 3.1-3.4 til den tilsvarende flowcytometri rør. Ved udgangen af dette trin, bør det endelige volumen i hvert rør være 175 pi.
- Vortex hvert rør. Der inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 25 min.
- Vask cellerne med vaskebuffer (PBS-opløsning indeholdende 0,1% bovint serumalbumin og 0,45 g / L NaN3).
ADVARSEL: Natriumazid er et giftigt stof. Udsættelse for selv små mængder kan forårsage symptomer. Håndter dette stof i henhold til de retningslinjer, der er angivet af Environmental Health and Safety (EHS) Kontor på den institution, hvor der bliver udført disse eksperimenter. - Centrifugerør ved 510 xg i 5 minutter. dekanteres forsigtigt supernatanten i en separat affaldscontainer. Sørg for ikke at forstyrre bundfaldet.
ADVARSEL: Du må ikke dekanteres vaskebuffer supernatant i reservoirer, der indeholder blegemiddel, da det kan reagere med natriumazid til stede i vaskebuffer og resultere i dannelsen af en giftig gas 34. Contakt EHS Kontor på den institution, hvor der bliver udført disse eksperimenter for retningslinjer for, hvordan til at disponere over natriumazid. - Efter dekantering, vortexes cellerne i efterladenskaber væske tilbageholdes i hvert rør.
4. Cell Fiksering
- Tilsættes 250 pi af en 2% paraformaldehyd (PFA) opløsning til alle rør til fikseres cellerne.
ADVARSEL: PFA er et giftigt stof. Udsættelse for selv små mængder kan forårsage symptomer. Håndter dette stof i henhold til de retningslinjer, der er angivet af EHS Kontor på den institution, hvor der bliver udført disse eksperimenter.- Da 2% PFA løsning skal være isotonisk med cellerne, bruge PBS for at forberede denne løsning. Et hundrede milliliter af en 2% PFA løsning er nok til flere eksperimenter. Grundigt vortexes alle rør umiddelbart efter tilsætning af 2% PFA for at forhindre dannelsen af celleaggregater.
- Der inkuberes i mørke ved 4 ° C i 20 min.
- Wash celler ved at gentage trin 3,7-3,9. Når dette trin er fuldført, kan cellerne opbevares i mørke ved 4 ° C i 24-48 timer. Inden vi går videre til Permeabilisering fase, Vortex rørene grundigt.
5. Permeabilisering Celler
- Der tilsættes 500 pi permeabilisering puffer. Vortex alle rør.
- Der inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 10 min.
- Vask cellerne ved at gentage trin 3,7-3,9.
6. Intracellulær Farvning
- Forbered nok mAb mester mix til at farve alle eksperimentelle rør.
- Juster lydstyrken med PBS eller plet buffer, således at 50 pi af den intracellulære mAb mester mix tilsættes per test.
- Forbered mAb mester mix beskrevet i 6.1 og 6.2 ved hjælp titreret mængder af mAbs rettet mod CD3 og Gzm B.
BEMÆRK: TCR engagement pMHC-I tetramerer kan resultere i CD3 internalisering, som kan interferere med påvisningen af tetramer + CD3 + CD8 +T-celler, hvis anti-CD3 mAb tilsættes til overfladefarvning mastermix. For at undgå dette, skal du tilføje den anti-CD3 mAb i denne fase, dvs. efter cellerne permeabiliseres. De fluorokromer konjugeret til hver mAb er opført som en reference: CD3 PerCP Cy5.5 og Gzm B PE. - Der tilsættes 50 pi mAb cocktail til de tilsvarende rør. Der inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 30 min.
- Vask cellerne ved at gentage trin 3,7-3,9. Rørene er klar til at blive erhvervet i et flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den her beskrevne protokol er blevet anvendt til at bestemme størrelsen og hukommelse fænotypen af vaccineinducerede, Gag CM9-specifikke CD8 + T-cellereaktioner i en Mamu-A1 * 001 + rhesus makak. Til denne analyse blev et APC-konjugeret Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 tetramer anvendes i en 8-farve flowcytometrisk farvning panel. Figur 1A - F viser gating anvendte strategi til at analysere de data, som skal anvendes for begge tetramerer til stede i hver test. Bemærk, at pMHC-I tetramer + CD8 + T-cellepopulationen er godt adskilt med minimal baggrund (figur 1F og G). Memory CD8 + T-celler i rhesus makakaber kan klassificeres som tre delmængder baseret på overfladen udtryk for CD28 og CCR7: central hukommelse (T CM; CD28 + CCR7 +), overgangs- hukommelse (T EM1, CD28 + CCR7-), og effektor hukommelse (T EM2; CD28-CCR7-) 35.Denne protokol omfatter også en celle permeabilisering skridt for intracellulær detektering af Gzm B og CD3. Figur 1G - I viser afgrænsningen af hukommelse delmængder og Gzm B-udtrykkende CD8 + T-celler i tetramer + gate.
Baggrundsfarvning kan give suboptimale resultater i pMHC-I tetramer mærkning assays. For at undgå dette, er foreslået et par forholdsregler. Som anført i protokollen sektionen, skal hætteglassene indeholdende pMHC-I tetramer reagenser altid centrifugeres ved 20.000 xg i mindst 15 minutter forud for udarbejdelsen af de master blandinger. Målet med dette trin er at pelletere eventuelle proteinaggregater, der kan være i pMHC-I tetramer opløsning. Derudover titrering hvert reagens før brug anbefales også. Ideelt set MHC-I-matchede celler, der forekommer eller ikke indeholder Ag-specifikke CD8 + T-cellepopulationen af interesse bør mærkes med den relevante pMHC-I tetramer. Denne can opnås ved farvning kryopræserveret PBMC fra SIV naive (negativ kontrol) og SIV-inficeret (positiv kontrol) makakaber side om side med forskellige mængder af en nyligt opnået pMHC-I tetramer. I figur 2, for eksempel, 1,0 pl / test af et APC-konjugeret Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetrameren gav den bedste adskillelse mellem tetramer positive og negative CD8 + T-cellepopulationer. Endelig valget af fluorochrom kan også signifikant indvirkning de opnåede resultater fra pMHC-I tetramer farvninger. I denne henseende pMHC-I tetramerer konjugeret til dim molekyler (f.eks fluorescein) bør undgås. Det er vores erfaring, pMHC-I tetramerer konjugeret til lyse fluorokromer, såsom PE, APC, og BV 421, har givet de bedste resultater.
Vi har bemærket, at Mamu-B * 017: 01 tetramerer giver typisk dim farvning, selv når konjugeret til de lyse fluorochromer nævnt ovenfor. Årsagerne til dettelav fluorescensintensitet er ikke helt klare, men kan omfatte lav affinitet TCR / Mamu-B * 017: 01 interaktioner og hurtig TCR-internalisering ved tetramer binding 36,37. Langs disse linjer, har PKIs blevet vist at inhibere TCR internalisering på overfladen af CD8 + T-celler 32. Som følge heraf kan PKIs forbedre påvisningen af Ag-specifikke CD8 + T-celler efter pMHC-I tetramerfarvning. Vi har bekræftet denne effekt i vores eksperimenter, hvor kvaliteten af Mamu-B * 017: 01 tetramer farvninger kan forbedres væsentligt ved at forbehandle PBMC med en PKI (figur 3). Mærkeligt, havde forbehandling med dette PKI ikke i væsentlig grad forbedre farvningen af andre testede here (data ikke vist) pMHC-I tetramerer, hvilket antyder, at Mamu-B * 017: 01-begrænsede CD8 + T-celler kan være unikke i deres følsomhed til PKI behandling.
Figur 1: gating strategi og repræsentative resultater af en vellykket pMHC-I tetramerfarvning. Vi vurderede størrelsen og hukommelse fænotypen af vaccineinducerede Gag CM9-specifikke CD8 + T-celler i PBMC fra en Mamu-A1 * 001 + rhesus makak. Her blev en APC-konjugeret Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 tetramer anvendes i en 8-farve flowcytometrisk farvning panel. (A - F) gating-strategi til flowcytometrisk analyse. Først blev en gate på diagonalt grupperet singletter skabt ved at afbilde forward scatter højde (FSC-H) versus FSC-området (FSC-A) og derefter sidespredning højde (SSC-H) versus SSC-området (SSC-A; A og B) . Dernæst blev en tid gate skabt, der omfattede kun de begivenheder, der blev optaget inden for de 5 th og 90 th percentiler. De resulterende celler blev derefter gatet på "dump kanal" negative, CD3 + celler (C og D). På dette stadiumlymfocytpopulation blev afgrænset baseret på dets FSC-A og SSC-A-egenskaber og de efterfølgende analyser blev udført inden CD8 + -celler (E og F). Efter skitserer pMHC-I tetramer + celler (G), blev hukommelse fænotype analyse udføres inden denne port (H). Rhesus makak memory T-celler kan inddeles i tre undergrupper baseret på ekspression af CD28 og CCR7: central hukommelse (T CM; CD28 + CCR7 +), overgangs- hukommelse (T EM1, CD28 + CCR7-), og effektor memory (T EM2 ; CD28-CCR7-). Den foreliggende protokol omfatter også en celle permeabilisering skridt for den intracellulære evaluering af Granzyme B (Gzm B) udtryk inden tetramer + CD8 + T-celler (I). Det skraverede område i histogrammet svarer til tetramer + CD8 + T-celler farvet med en isotype-matchet kontrol-mAb. Selvom BV 421-konjugeret tetramer + population, der var til stede i denne farvningen erikke vist i figuren, bør den samme gating strategi anvendes til at analysere den. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative resultater af titreringen af en APC-konjugeret Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetramer. PBMC fra to Mamu-B * 008: 01+ makakaber blev anvendt til dette eksperiment: et dyr var SIV naive og tjente som den negative kontrol, mens den anden var SIV-inficerede og tjente som den positive kontrol. For at bestemme mængden af Mamu-B * 008: 01 / Nef RL10 tetramer, der giver den bedste adskillelse mellem tetramer + og tetramer- CD8 + T-celler, PBMC fra hvert dyr blev inkuberet med de angivne mængder af pMHC-I tetramer reagens. Baseret på disse resultater, 1,0 pl / test was er valgt som den optimale mængde, som skal anvendes i fremtidige assays. Gating strategi anvendes til at analysere de data, er beskrevet i figur 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Virkningerne af PKI behandling på fluorescensintensiteten af Mamu-B * 017: 01 tetramerer. PKI inhibitor inhiberer internalisering af TCR-komplekser og derved forbedrer påvisning af Ag-specifikke CD8 + T-celler ved fluorochrommærkede pMHC-I-tetramerer 32. (A - B) PBMC fra to Mamu-B * 017: 01+ makakaber blev anvendt i dette eksperiment: en abe var SIV naive og tjente som den negative kontrol (A), mens den anden blev inficeret med SIV og tjente somden positive kontrol (B). PBMC fra både dyr blev inkuberet ved 37 ° C i nærværelse af PKI ved en koncentration på 50 nM i 30 minutter før farvning med et APC-konjugeret Mamu-B * 017: 01 / Nef IW9 tetrameren, som beskrevet i afsnittet protokol . Som reference blev et andet sæt af rør underkastet de samme inkuberingsbetingelser og farvningsbetingelser, bortset fra at dimethylsulfoxid (DMSO) blev tilsat i stedet for PKI. Gating strategi anvendes til at analysere de data, er beskrevet i figur 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
| SIV protein | Aminosyreposition | Aminosyresekvens | MHC klasse I-molekyle (nye nomenklatur) | MHC klasse I-molekyle (gamle nomenklature) | Epitop Short Name |
| gag | 181-189 | CTPYDINQM | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag CM9 |
| gag | 254-262 | QNPIPVGNI | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag QI9 |
| gag | 72-79 | GSENLKSLY | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | gag GY9 |
| env | 830-838 | FHEAVQAVW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | env FW9 |
| env | 233-241 | CAPPGYALL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | env CL9 |
| env | 620-628 | TVPWPNASL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | env TL9 |
| env | 788-795 | RTLLSRVY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | env RY8 |
| env | 296-304 | RTIISLNKY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | env RY9 |
| Vif | 123-131 | RRAIRGEQL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif RL9 |
| Vif | 173-181 | RRDNRRGL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Vif RL8 |
| Vif | 66-73 | HLEVQGYW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Vif HW8 |
| Vif | 100-109 | VTPNYADILL | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Vif VL10 |
| Vif | 97-104 | WTDVTPNY | Mamu-A1 * 002: 01 | Mamu-A * 02 | Vif WY8 |
| Rev | 13-22 | KRLRLIHLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Rev KL9 |
| Tat | 28-35 | STPESAML | Mamu-A1 * 001 | Mamu-A * 01 | Tat SL8 |
| Nef | 137-146 | RRHRILDIYL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL10 |
| Nef | 246-254 | RRLTARGLL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9b |
| Nef | 8-16 | RRSRPSGDL | Mamu-B * 008: 01 | Mamu-B * 08 | Nef RL9a |
| Nef | 165-173 | IRYPKTFGW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef IW9 |
| Nef | 195-203 | MHPAQTSQW | Mamu-B * 017: 01 | Mamu-B * 17 | Nef MW9 |
| Nef | 159-167 | YTSGPGIRY | <td> Mamu-A1 * 002: 01Mamu-A * 02 | Nef YY9 |
Tabel 1: Liste over pMHC-I tetramerer tilgængelig for tilsyn SIV-specifikke CD8 + T-celle responser i makakaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et par skridt i denne procedure fortjeneste diskussion, da de er afgørende for at give optimale resultater. Først, da kvaliteten af de biologiske prøver er en stærk indikator for succes for enhver flowcytometrisk assay 38, skal der tages alle omhu for at sikre, at cellerne er levedygtige og i suspension under farvningen procedure. Dette er særlig relevant, når der arbejdes med kryopræserverede prøver, da de er mere tilbøjelige til at klumpe og indeholder typisk højere antal døde celler. I disse tilfælde passerer cellesuspensionen gennem en 70 um cellefilter før proceduren pMHC-I tetramer mærkning kan væsentligt forbedre resultaterne. For det andet, passende kompensation for de fluorokromer ansat i analysen er kritisk for nøjagtig dataanalyse, især når flere parametre evalueres i det samme eksperiment. I denne forbindelse anbefales det, at frisk kompensation ensfarvet kontroller være forberedt på hver pMHC-I tetramer sTaining assay. Vi går ind for brugen af kompensation perler på grund af deres brede anti-Ig reaktivitet og det faktum, at de giver klare bimodale fordelinger af positive og negative populationer. Da disse perler ikke binder til MHC-I-molekyler, antistoffer konjugeret til de samme fluoroforer som de pMHC-I tetramerer (f.eks APC og BV 421) må anvendes som kompensation kontroller. Flere af disse erstatninger perler er tilgængelige fra flere leverandører og bør anvendes i overensstemmelse med producentens anvisninger. For det tredje, da fænotype strategi beskrives her kræver afgrænsning af CD8 + T-celle-undergrupper baseret på gradueret ekspressionen af tre molekyler (dvs. CD28, CCR7, og Gzm B), gating kontrol, såsom fluorescens minus én (FMO) tests eller isotype-matchede antistoffer, bør anvendes til at lette disse typer af analyser. I vores eksperimenter, for eksempel, separate rør, der indeholder pMHC-I tetramer + CD8 + T-celle population af interesse enre altid farvet med isotype kontrol-mAb'er konjugeret til samme fluorochromer som mAb'erne mod CD28, CCR7, og Gzm B. Vigtigt er det, selv om de førnævnte retningslinjer, kan hjælpe med at forbedre den samlede kvalitet af pMHC-I tetramer farvninger, er de ikke de eneste variable, kan påvirke udførelsen af dette assay. I betragtning af den unikke i hvert laboratorium indstilling, skal udføres hele arbejdsgangen beskrevet her mindst én gang på mock prøver at give mulighed for praksis og relevante justeringer.
Mærkeligt, pMHC-I tetramer positive CD8 + T-celler er lejlighedsvis observeret i PBMC fra SIV naive (ikke-inficerede og ikke-vaccinerede) makakaber. Disse tilfælde synes ikke at være resultatet af baggrundsfarvning baseret på visuel inspektion af dataene. Snarere kan de afspejler interaktioner mellem pMHC-I-molekyler og killer immunoglobulinlignende receptorer (KIR'er) udtrykt på overfladen af rhesus makak NK og CD8 + T-celler 39,40. Faktisk Mamu-A1 * 002: har 01 tetramerer foldet med peptider svarende til de Gag GY9 og Env RY8 epitoper blevet vist at binde til Mamu-KIRDL05 39. Langs disse linjer, Mamu-A1 * 002: 01 / Gag GY9 og Mamu-A1 * 002: 01 / ENV RY8 er mere tilbøjelige til at udstille Ag-uafhængige pMHC-I tetramerfarvning beskrevet ovenfor. Givet dette fænomen, er det vigtigt at styre denne baseline reaktivitet i abe forsøg med langsgående vurderinger af SIV-specifikke CD8 + T-celle-responser efter infektion eller vaccination. For at opnå dette, er det tilrådeligt at udføre pMHC-I tetramerfarvning på prøver opnået på den første dag af behandlingen. Det kan også være relevant at fryse PBMC i flere små-størrelse portioner på disse indledende tidspunkter i tilfælde sammenligninger med der er behov baseline prøver i fremtidige eksperimenter.
En begrænsning ved pMHC-I tetramerfarvning er, at kun CD8 + T-celler med kendt specificitet og MHC-I-restriktionssted cen blive undersøgt af denne fremgangsmåde. Dette er især relevant i rhesus makakaber givet den komplekse organisering af deres MHC loci. Faktisk kan en enkelt rhesus makak haplotype har snesevis af MHC-I-gener, som ikke alle koder molekyler, som er stabilt udtrykt på celleoverfladen 29. Som følge heraf kan det være vanskeligt at bestemme det sæt af funktionelle MHC-I-molekyler udtrykt af en givet dyr. Ikke desto mindre kan denne advarsel overvindes ved at designe eksperimenter, der omfatter aber, der er positive for kendte MHC-I-alleler, såsom Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, og Mamu- B * 017: 01.
Afslutningsvis dette håndskrift giver en optimeret pMHC-I tetramerfarvning protokol til bestemmelse af frekvensen og hukommelse fænotypen af SIV-specifikke CD8 + T-celler i makakaber. Da pMHC-I tetramerfarvning er mere følsom end IFN-γ-ELISpot og ICS assays til detektion af Ag-specifikke CD8+ T-celler og kræver ikke in vitro Ag-stimulering, den metode præsenteret her er især nyttig til at studere virkningen af CD8 + T-cellereaktioner i udfaldet af immundefekt virusinfektion. Den praktiske viden erhvervet fra mastering denne teknik kan også være nyttige til at berige Ag-specifikke CD8 + T-celler som en del af funktionelle undersøgelser og for overvågning CD8 + T-celle-responser i forskellige sygdomstilstande indstillinger 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke David Watkins til at understøtte de eksperimenter, gjorde det muligt for optimering af den nuværende metode. Forskning rapporteret i denne publikation blev delvist understøttet af en pilot tilskud fra Miami Center for AIDS Research af National Institutes of Health under award nummer P30AI073961. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dasatinib | Axon medchem | Axon 1392 | Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20 °C |
| RPMI w/ Glutamax | gibco/ Life Technologies | 61870-036 | Must be stored at 4 °C |
| Heat Inactivated FBS | gibco/ Life Technologies | 10082-147 | Must be stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Must be stored at 4 °C |
| DMSO, Anhydrous | Life Technologies | D12345 | Store at room temperature. |
| 5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes | VWR | 60819-728 | |
| Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers | NIH Tetramer Core or MBL, Inc. | Must be stored and maintained at 4 °C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze. | |
| Fluorochrome-conjugated mAbs | Various companies | Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze. | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | l34957 | Must be stored at -20 °C. Resuspend each aliquot in 50 μl of DMSO prior to use. |
| Brilliant Stain Buffer | BD Biosciences | 563794 | Must be stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | VWR | 97064-158 | Store at room temperature |
| Albumine Bovine | VWR | 700011-230 | Must be stored at 4 °C |
| Sodium Azide | VWR | 97064-646 | Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach. |
| Bleach | VWR | 89501-620 | Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care |
| Polysorbate 20 (Tween-20) | Alfa Aesar | L15029 | Store at room temperature |
| Permeabilization Solution 2 | BD Biosciences | 340973 | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Sarsdet Tubes 1.5 ml screw top | VWR | 72.692.005 | |
| 2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes | Eppendorf | 22431048 | The use of Sterile microtubes is preffered |
| Vortex mixer | To discretion of scientist | ||
| Biosafety Cabinet | To discretion of scientist | ||
| Milli Q Intergral Water Purification system | EMD Millipore | ZRXQ010WW | Molecular Biology grade water from any provider may be used |
| Microcentrifuge | To discretion of scientist | ||
| Centrifuge | To discretion of scientist | ||
| 4 °C refrigerator | To discretion of scientist | ||
| BD LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | |
| Deionized water | |||
| Aluminum Foil | VWR SCIENTIFIC INC. | 89068-738 | |
| Incubator | Must be able to maintain 37 °C internal temperature | ||
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Flowjo software version 9.6 | Flowjo | Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software | |
| Micropippette tips |
References
- Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
- Doherty, P. C.
- Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).
- Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
- Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
- Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
- Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
- Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
- Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
- Valentine, L. E., et al. Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
- Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
- Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
- Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
- Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
- Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
- Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
- Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
- Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
- Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
- Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
- Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
- Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
- Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
- Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Weatherall, D. The use of non-human primates in research. A working group report. , 152 (2006).
- Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).
- Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316 (2011).
- Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145 (2015).
