Summary
在心脏，分子事件坐标器官的电气和收缩功能。一套这里提出局域场荧光显微镜技术能使在完整的心中蜂窝变量的记录。识别定义心脏功能的机制是关键了解的心脏在病理情况下是如何工作的。
Abstract
在心脏，分子信号研究在离体心肌细胞通常执行。然而，许多如局部缺血和心律失常病理情况只能完全在整个器官水平的理解。在这里，我们提出局域场荧光显微镜（LFFM）的光谱技术，允许在完整心脏细胞信号的测量。该技术是基于一个的Langendorff灌注的心脏和光纤，记录荧光信号的组合。 LFFM在心血管生理学领域的各种应用研究正常和病理条件下的心脏。多个心肌变量可以使用不同的荧光指标进行监测。这些措施包括细胞内钙离子浓度 ，内肌浆网内钙和膜电位。外源荧光探针很高兴与LFFM落射荧光技术的三种不同的安排检测发出的荧光■在本文提出。这些技术中的中心差异是用于激励和激励光进行调制的方式的光源的类型。脉冲LFFM（PLFFM）采用激光光脉冲，同时连续波LFFM（CLFFM）使用连续激光激发。最后，发光二极管（LED）被用作第三光源。该非相干安排被称为脉冲LED荧光显微镜（PLEDFM）。
Introduction
心脏是心血管系统的中央机关。心脏的收缩是由细胞内增加钙离子浓度开始。在细胞内Ca 2+释放电兴奋和变化之间的关系已经在历史研究了酶促解离的细胞1,2。然而，心脏细胞电，代谢和机械地联接3,4。当隔离，肌细胞不仅是身体上脱开，但是从不同层细胞的解离5中混合。此外，尽管已经从分离细胞的研究中出现电压钳条件下的巨大优势，6，7，8心脏的内在性质为电合胞体ALWAYS构成如何功能不同的是从那些存在于组织3解离的细胞的问题。
在这个手稿中，我们描述了在完整的心脏采用局部场荧光显微镜（LFFM）技术在心脏生理知识获得的进步。 LFFM使用荧光指标来衡量多种生理变量，如细胞内钙离子 ，内肌质网（SR） 钙和膜电位。这些测量可以同时并结合心室压9,10，心电图9，电气动作电位（AP）的，离子电流的录音和笼化合物4的闪光光解，11来获得。此外，这些测量可以通过在更高的频率接近起搏完整心脏得到R以生理率。尽管一些文章9，11，12，13，14已使用LFFM技术我们集团公布，技术与该技术相关的复杂的推定阻止在心脏和其他器官研究体外生理现象它的大规模使用。
所述LFFM技术（ 图1）是基于使用在与组织接触的多模光纤获得萤光测量。像任何接触荧光成像技术，光学分辨率取决于直径和光纤的数值孔径（NA）。光纤的较高NA和较小直径将增加测量的空间分辨率。的NA和纤维直径的范围可以从0.22至0.66，并从50微米至1毫米。在压痕的NA将通过接受从较大的立体角到达光子提高信噪比（S / N）。为了充当萤光设备中，光束被聚焦到光纤用的非球面透镜或落射荧光物镜，其中透镜的NA和光纤匹配。该匹配最大化为激励和用于收集回由荧光团发射的光子的能量传递。
为了激发在组织中加载的外源性荧光指示器，不同的光源和照明模式都可以被利用。我们使用脉冲局部场荧光显微镜3，12（PLFFM）开拓性的研究中采用的低成本皮秒激光器（ 图1a，PLFFM）。这种类型的光源的具有照明区域下荧光团分子的激发大级分的巨大优势，而基本上不漂白由于染料以短脉冲持续时间12。此外，使用超短脉冲的允许的染料12的荧光寿命的评估。荧光寿命是可用于量化绑定到的 Ca 2+染料分子的分数属性。不幸的是，从脉冲到脉冲的脉冲和变化的幅度的时间抖动限制本实验策略来的情况下通过配体结合到染料产生的荧光变化是大的应用程序。
连续波（CW）激光器通常用作LFFM（ 图1b，CLFFM）的主要照明源。激光束可以连续照亮组织或可以ferroelectrically调制。的光束的强电介质调制让光微秒脉冲的产生。这种调制可以通过外部硬件进行控制。这个过程不仅极大地降低了Ť他光脉冲的时间抖动也可以让混合不同波长的光束。束的混合是通过从不同的激光器多路复用射线进行。其结果是，具有不同的光谱特性的多个染料可兴奋来执行的各种生理变量的测量，例如，RHOD-2细胞内的Ca 2+，MagFluo4帧内-SR 的 Ca 2+和二-8- ANEPPS为膜电位。
尽管激光器本各种优点如LFFM光源，其它类型的光源可以使用，包括发光二极管（LED）。在这种情况下，激励光源组成的InGaN LED（ 图1c，PLEDFM）的。在发光二极管中，当从导带的电子与价带中空穴复合光子自发发射。与固态激光器的区别在于，发射不被其他光子激发。这导致了非相干光束和LED的更宽的光谱发射。
可用于不同类型的高功率LED。对于AP的记录用迪-8- ANEPPS和钙使用的Fluo-4或幅度-的Fluo-4，我们使用了在485纳米（蓝）和20nm的半值宽度具有典型的峰值发射的LED记录2+瞬变（ 图1d）。对于记录有RHOD-2 的 Ca 2+瞬变，该LED在540nm（绿色）和35纳米（ 图1d）的半高宽了一个典型的峰值发射。 LED发出的波长频段，因此需要过滤器来缩小他们的光谱发射。另外，可在1.6千赫为20微秒的持续时间的比率来产生脉冲光。这些LED用一个快速的功率MOSFET场效应晶体管脉冲。同时进行的录像用不同的指标可通过时分复用的指示灯来执行。不幸的是，由LED发射的光更难以集中到光纤相比的激光束。因此，我们的主要缺点ING的LED是，它们的发射轮廓具有从主轴线的角位移（±15°），和一个辅助光学必须使用纠正它。
在所有先前描述的光学结构中，激发光被反射用的分色镜的帮助。光束随后通过非球面透镜和一个显微镜物镜上被定位在组织中的多模光纤聚焦。正如在任何萤光布置中，分色镜还用于激励从所发射的光中分离出来。所发出的光频谱旅行回到通过屏障过滤器，以消除任何反射的激发。最后，发射的光与目标聚焦到光检测器（ 图1）。
从光到电的电流的传导是由硅雪崩光电二极管进行。这些二极管具有快速响应和高灵敏度，允许低光检测。该由雪崩光电二极管产生的光电流可以用两种方法来扩增：具有跨阻抗放大器的电阻反馈元件（ 图1E）或通过积分将电流转换成电压（ 图1F）。使用第一种方式，输出电压正比于光电流和反馈电阻。电阻检测皮秒激光脉冲的一个典型的例子示于图2a，2b和2c。面板2a示出了跨阻放大器的输出和面板2b示出了具有一个星号（*）指示的时间间隔的一个时间扩展。峰值跟踪算法被实施以检测荧光反应12峰（红色）和底座（绿色）。碱荧光的测量提供了受环境韧带引入两个雪崩光电二极管的暗电流和干扰的信息HT和电磁耦合。峰和碱的表示示于图2c中。该图中示出了由打浆鹦鹉心脏的心动周期中结合到钙染料（RHOD-2）发出的荧光。
在第二种方法中，积分器的输出电压是电流和电容反馈的函数（ 图2d，2e和2f）的 。 图2F示出了两个连续的积分周期：第一，没有外部照明和所述第二带从一个脉冲的LED施加的光脉冲。的详细描述示于图2g和2小时 。这种方法，虽然更费力，提供了一个较大的S / N由于没有在反馈电容器热噪声。仪器包括产生激发光的所有的控制和多路复用并命令探头整合和水库的定时阶段等周期。这通常是用一个数字信号处理电路，还通过计算数据的一个在线回归进行综合输出信号的数字分化进行。在使用电阻反馈的情况下，可使用任何A / D采集板。
最后，我们的LFFM技术是高度通用的，并且可以适合于从一个以上的区域进行记录。在光路中加入一光束分离器可以使我们的光分成两个光纤。然后各光纤可以被放置在一个组织，以独立地，激发并从外源荧光探针记录发射的不同区域。这一修改使我们能够评估区域如何解剖学上的差异影响生理变量。 图3示出一个分束器所采用分裂，使得两个光纤被用来测量透电或细胞内的CW激发光的[Ca 2+]的水平机智^ h轻微的侵入性。透的信号可以通过将在内膜一种纤维和其它心室壁的外膜层上进行记录。因此，LFFM技术具有以测量蜂窝信号的不同区域的时间过程的能力，并且可以使用，如果在病理情况下发生的区域的变化进行测试。
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Protocol
该协议并且所有小鼠处理批准了加州大学默塞德机构动物护理和使用委员会（编号2008-201）。与鹦鹉实验于1999年根据由委内瑞拉科学研究所（IVIC）的科学委员会设立动物使用一般政策进行的。
1.的Langendorff成立准备
- 制备的台罗德氏溶液含有以mM以下溶质浓度：140的NaCl，5.4氯化钾，2的CaCl 2，1 MgCl 2的，0.33 的 Na 2 HPO 4，10葡萄糖，10 HEPES。调整台罗德氏溶液，以7.4用NaOH的pH值和过滤通过0.22微米的过滤器将溶液。
- 装载台氏溶液到60毫升的注射器和设置在图4所示11，12中的水平的Langendorff的所有管道。确保消除所有气泡。
- 塑料管连接到O 2罐。
- 添加塑料底座适配器降低5“管插入的60毫升注射器台氏液。
- 塑料气石连接来了5“管的末端所以O 2将泡出到台氏液。
- 放置一个非吸收性外科缝线围绕用作套管针。针被连接到歧管（ 见图4），允许复古灌注不同的解决方案。最后，心脏的主动脉将空心进针。
2.动物的制备与心脏解剖
- 肝素称量并注入鼠标（例如，鼠标的重量20克，用20单位或200微升注入）颈椎脱臼安乐死前15分钟。麻醉鹦鹉根据：Ø您的IACUC协议的动物使用教程，然后继续进行颈椎脱位。
注：使用8周龄小鼠或20克鹦鹉。 - 从安乐死后胸腔中取出心脏。作为描述小鼠中提取完全相同的方式鹦鹉心。
- 清洁用乙醇鼠标胸口。
- 使用夹层剪刀，做一个切口下腹部，然后切开两侧朝脖子。
- 拉回切割组织和引脚下来。
- 切隔膜。切割膜片时要避免损坏心脏要小心。
- 取出肺和周围的组织。
- 使用镊子舀心脏不受挤压它。尽可能长时间地切主动脉。
- 与约1毫升台氏液运送一个小权衡船的心脏。
- 使用非吸收性外科缝线，通过扎到大动脉水平的Langendorff设备针。领带的心脏主动脉有两个细镊子的帮助。打开位于与含台氏液60毫升注射器系列阀门开始复古灌注。
- 让心脏稳定10分钟。利用这段时间来清洁血液和加载染料之前心脏周围的脂肪组织。拉用镊子心脏的基地附近的脂肪组织，并用小解剖剪刀剪。一定要做到这一点解剖显微镜的视野下。
3.胞质钙测量：准备染料RHOD-2AM
- 添加20％普朗尼克20μL的（非离子表面活性剂）在DMSO中，通过在含有该染料的50微克的染料制造商提供的特殊包装的塑料小瓶中。
- 吹打向上和向下，避免气泡混合。
- 与非离子表面活性剂和从特殊包装的塑料管形瓶中的染料成透明玻璃小瓶转移混合DMSO中。加入1毫升台氏SOLU的重刑透明玻璃小瓶。
- 超声处理用于在槽式声波处理器15-20分钟。
- 使用蠕动泵在室温下30分钟灌注染料。
- 放置染料在染料腔室。
- 使用机械夹具压缩所有连接到歧管的另一管道线。夹具被放置在歧管的上方。这将防止任何回流到连接到60毫升的注射器管。
- 打开灌注蠕动泵开始循环的染料。立即关闭60毫升注射器低于三通阀。
- 定位连接到旁边的心脏抽吸蠕动泵再循环已灌注到心脏的染料的小管。
4.内部-SR 钙测量：准备染料幅度- Fluo4AM
- 以相同的方式作为RHOD-2AM制备幅度 - Fluo4AM。请参见3逐步说明。
- AFTER装入染料，打开位于含台氏液，开始复古灌注的60毫升注射器系列阀门。一定要去掉上面歧管钳。
- 加台罗德氏溶液，以在水平腔和温热至37℃。
- 复古与灌流45分钟台氏液以去除细胞内的染料。
5.膜电位测量：准备染料迪8 ANEPPS
- 加入5毫升99％的乙醇对包含5毫克染料的染料小瓶中。
- 分装10μL到使用中继器吸管500个人的1毫升塑料小瓶。
- 变干的速度真空并储存在-20℃。
- 添加20μL的20％泊洛尼克于DMSO至塑料小瓶中的干燥的染料的10微克。
- 吹打向上和向下，避免气泡混合。
- 含DMSO加普朗尼克和染料混合传输从塑料小瓶量筒（10毫升）中。加台氏溶液至最终沃5毫升lume明。
- 超声处理用于在槽式声波处理器20-25分钟。
- 灌注到心脏，使用蠕动泵30分钟。请参阅逐步说明3.5节。
6。心外膜录音信号
- 装载染料后，通过去除所述歧管上方的钳复古灌注与台罗德氏溶液的心脏。打开位于与含有台罗德氏溶液的60毫升注射器系列阀门。 10分钟复古灌流台氏液，以稳定心脏。
- 填充台氏溶液的水平腔和转动珀尔帖单元上以使浴温至37℃。
- 心脏的表面上的光纤位置。
- 放置一个2毫升吸管内的光纤，然后将吸管连接到一个显微。
- 使用显微稍微按下光纤对LV的表面上。
- 外部的步伐老天由波发生器控制的刺激室温。
- 程序中的波发生器提供方波脉冲为1ms的宽度。
- 设置为外部同步刺激器和外部输入连接到波发生器。
- 为了刺激器的每个输出，并在最后的焊接针针连接线。
- 放置两个针灸针在心脏约3mm彼此分开的顶点。
- 针被放置在组织后才，打开刺激器的输出，以防止触电。
- 在采集软件，调整频率采集到10kHz。
7。记录心内膜信号
- 参照步骤6.1和6.2加载染料后，以稳定的心脏。
- 关于使用光纤的规模急剧23Ga点，使心脏的表面的小孔中隔附近的LV。 <li>将一玻璃体内手术巩膜适配器在使用显微第一光纤定位到心内膜，以帮助。
- 外部踱步的心脏。参见步骤6.4。
- 在采集软件，调整频率采集到10kHz。
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Representative Results
美联社和钙 瞬变的心内膜和心外膜
以横跨心室壁比较信号，一个光纤被定位在内膜和另一个在外膜。从心内膜从心外膜记录与一个AP的形态相比较是评估透功能的最佳方式。室壁是高度异质性，因此，受影响的形态是在这两个区域有很大不同。这是众所周知的，该心内膜少我到比心外膜17，18，19。少我到使第1阶段较慢的心内膜18，20的复极化。 图5b SHOWS的AP从心内膜和心外膜的典型光学记录。要执行这些录音，小鼠心脏装有电位染料二8 ANEPPS和使用CLFFM技术测定荧光。光学记录AP的形态，特别是在第1阶段，示出相比于心外膜的心内膜的一个较慢的时间过程（动作电位持续时间（APD）30是8.01毫秒±2.5）（3.4毫秒±0.59）（ 图5b）。在一般情况下，APD的可被描述为它需要在AP至repolarize一定比例包括30，70或90（ 图5a）的时间。这些迹线已被归一化并且转移到具有重叠相位0。当比较的APD（ 图5c），我们可以看到，心内膜和心外膜阶段1期间是显著不同尽管这些AP是荧光信号，它们可被校准到特定的通过用同时测量该AP膜电位尖锐的微电极装满3米氯化钾13。
除了膜电位，外源性荧光指标可用于监测细胞内的[Ca 2+]。通常情况下，我们使用RHOD-2AM来测量，因为它的高动态范围和其甚至在生理温度停留在细胞质能力细胞内Ca 2+瞬变。 图6b示出了心内膜和心外膜层细胞内Ca 2+瞬变的典型记录。这些结果已经公布部分15。为了比较在细胞内区域差异的[Ca 2+]的水平，所述的 Ca 2+瞬变的动力学进行了评估（图6a）。总体而言， 钙瞬变动力学（ 图6c）的分析表明，从心内膜的钙瞬变过显着高于从心外膜记录动力学较慢。
钙动力学的SR管腔
在心脏，上升和细胞内的秋天钙离子浓度水平在定义很多生理变量包括压力，收缩力，动作电位时程（APD）的关键。前面已经介绍了我们的测量细胞内钙瞬变的能力。该钙 从SR释放是在细胞内的细胞内的Ca 2+上升的主要原因。因此，对于细胞内Ca每上升2+存在的 Ca 2+ 枯竭的SR。然而，细胞内的Ca 2+瞬变并不单单由于SR 的 Ca 2+释放，而且还包括的 Ca 2+进入细胞通过质膜。我们的实验室16已经能够评估通过使用荧光染料，幅度-荧光- 4AM的SR 钙含量。虽然此染料在myoplasm和SR脱酯化，肌细胞可以挤出出胞质级分。该染料挤出可以通过简单地提高温度至37℃来促进。在此温度下，胞浆染料被类似膜蛋白的ATP结合盒移除。幸运的是，这种蛋白质中不存在的SR膜。因此，温度上升至37℃后，使用PLFFM技术记录荧光多半是的 Ca 2+结合到SR内的染料的结果。为了测试该细胞器测量的特异性，咖啡因脉冲施加通过RyR的刺激的 Ca 2+释放。它是可以观察到的信号是确实对SR耗尽（ 图7）的结果。咖啡因引起的SR 钙释放（ 图7A）同时生产，在幅度-的Fluo-4的荧光的舒张水平的降低（92±0.05％（N = 4，P = 0.012））和钙瞬变（51±0.21％的振幅降低（N = 4，P = 0.003））16。前记录帧内SR迹线和咖啡因刺激后向下在图7b-7D是表示。随着时间从咖啡因刺激的进展，对SR耗尽的振幅较小。 图7E示出的SR耗尽不仅诱导的钙信号的幅度的减小，而且减慢的SR 的 Ca 2+释放的过程。 图7A的荧光痕迹，已经出版15。
脉冲LED：动作电位
在图5中我们发现，迪-8-ANEPPS可以报告修改在膜电位时，它在532纳米的激发。根据本激励条件，还有比590nm处更高的发射的荧光的波长的减小。有趣的是，当该电位染料被激发接近其最大激发波长（〜476纳米），染料转移到较低的波长时，膜去极化的荧光发射。因此，这种谱移允许我们在两个不同的波长来记录所发射的荧光。这个光谱特性迪-8-ANEPPS允许录制两个不同波长的发射的荧光，这一特点通常是很有价值的，因为最后计算的记录将是独立于膜的染料浓度的配给。为了取二 - 8-ANEPPS谱移的充分利用，我们使用脉冲的LED作为光源。我们使用脉冲蓝光激发荧光团。励磁在485纳米，接近迪-8-A的峰值吸收波长进行NEPPS（〜476纳米）。采集在两个不同的发射光谱频带允许率形成和提高的S / N和在收缩，其中机械解偶联剂II型肌球蛋白没有被使用的心抑制共模噪声像环境光线和运动伪影的能力。这种情况对于实验条件，其中需要同时测量的心脏的和两个机械活动的 Ca 2+瞬变的动力学非常重要的。
该PLEDFM的时序图在图8a中示出。该图包括用于光检测探头，LED的开闭定时和模拟 - 数字转换的整合和复位控制逻辑。在AP的时间过程中，在绿色波长频带检测出的荧光显示，而在红光波段检测出的荧光减少强度的增加。 图8B示出通过膜去极化产生的荧光信号的变化在不同的方向移动。然而，由心脏收缩所产生的运动伪影总是定向在相同的方向，独立的发射波长。如前面所解释的，两个通道（绿色和红色）的数据必须是软件空调计算比之前。调理包括偏移和增益校正。偏移和增益水平修正的选择不是自动的。该软件的用户有选择变量的比值之前调理的痕迹。在面板8b中得到的比率（ 图8）示出了由心肌运动引入的伪影已取消。
二-8- ANEPPS荧光的AP中的相对变化通常非常小（〜每100毫伏8％）。此二- 8-ANEPPS荧光变化大于由钙结合蛋白产生所述一个小得多g至RHOD-2（<200％）。因此，为了增加信号以二 - 8-ANEPPS的信噪比，多个记录可以被平均。
脉冲LED：钙的同时录音 2+ 和膜电位
使用这种实验方法的最后一个目标包括在执行钙瞬变和AP的同时进行录音。多种生理信号的同时记录需要解决与系统的不同方面，包括技术上的困难：在光源与光纤耦合，该染料的吸收光谱与LED的发射匹配，模拟和数字电子电路设计到生成定时和采集以及快速软件开发来分析在线数据。
在欧R研究，染料的选择取决于其光谱特性。用于测量不同的信号Flourophores必须在不同的光谱波段吸收。这个条件是必需的信号源之间进行区分。该具有不同波长的LED被用于激励组织每一次，在荧光检测的对应于与在该波长下吸收的染料相关的信号。以这种方式，荧光发射来自不同的染料来，但在相同的波长带，可以通过在其每一个被激励的时间来区分。
然而，染料的光谱之间的串扰不能完全避免。这是因为，染料的光谱吸收特性使它们与波长远离其峰吸收吸收光。在我们的实验中，串扰在两种方式制作：（1）RHOD-2由蓝色LED被激发时，添加的 Ca 2+信号的红色信道均衡升的AP迹，和（2）二- 8-ANEPPS由所述绿色LED，它出现在钙瞬变信号（ 图9F）激发。此串扰可在线进行修正， 如图9所示。该过程的工作，因为侵入信号是需要被测量的信号的一小部分。最后，使用这种类型的fluorecence的代数处理从染料使得我们能够分离的AP（ 图9d）形成的 Ca 2+瞬变（ 图9H）。该处理的详细提纲中的图例说明。重要的是要注意到所有的脉冲LED实验进行了28°C是非常重要的。
图1： 局部场荧光显微镜（LFFM）。该LFFM由落射荧光安排使用的多模光纤，其与所述组织接触，以记录从灌注到心脏外源染料发射的荧光。所述LFFM设置可以使用三种不同的光源包括：（a）PLFFM，其中激发光通过脉冲微微钇铝石榴石激光器提供; （ 二 ）CLFFM，其中连续波激光器的使用和光脉冲由一个铁电调制器允许具有不同波长的激光的多路复用生成的;及（c）PLEDFM，其中发光二极管具有的发射峰（ 四 ）485 nm，对于蓝色和绿色LED 540纳米更广发射光谱，分别以电子脉冲的。当使用激光源，该光束由光束扩展器被散焦。最后，分色镜和物镜聚焦光束到所述光纤的远端被对着组织略微加压。所发出的光传播回通过相同的光纤，分色镜，EMI裂变过滤器，并聚焦到一个雪崩光电二极管，其中光子转换成电流。电流可以通过这两种方法（E）跨阻放大器，其中，所得到的输出电压成比例的光电流和反馈电阻被放大; （ 六 ）积分器，其中输出电压是电流和电容反馈的功能。最后，该信号被一个A / D转换器获得的，并在计算机上查看。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 阻性和容性转换。 （a）该电阻检测皮秒激光脉冲的一个典型的例子被示出。星号（ 二 ）表示时间扩展间隔，其中一个峰跟踪算法被实施，以检测峰值（红色）和碱（绿色）。 （ 三 ）从高峰和基地录音计算痕迹的形式呈现在7赫兹外部节奏设定为37℃，在跳动的心脏鹦鹉RHOD-2荧光反应和浴温度。 ð至h）通过使用电容反馈的积分器转换的光电流。完整的小鼠心脏钙瞬变的典型记录显示在两个不同时间尺度（d和e）。 （f）与和不带LED照明的两个连续循环的积分被示出。的信号增加的积分直线作为光电流充电反馈电容器。的依赖于时间的积分（黄褐色（Ɵ））的斜率正比于由在p感应光子撞击雪崩结除了电子 - 空穴复合的数量hononic活动时雪崩二极管没有检测到任何光子。数字信号控制探头积分和复位周期被在图G中所示。在非照明（DC）和LED照明周期（F）检测的信号示于面板小时。 F和直流的减法提供荧光的实际测量检测到的从小鼠心脏的 Ca 2+瞬变9赫兹外部节奏在37℃（ 小时 ）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：LFFM 的心外膜和心内膜测量。所述CLFFM设置用于测量从存在于心外膜的外源性荧光染料发射的荧光Ð心内膜层。增加了一个光束分离器的便利的心外膜和心内膜不同的生理变量的记录。两个光纤用他们的个人的探头用于从心外膜和心内膜，以检测。一个小的环形切口是在心室制成，光纤被拧过，从心内膜记录。这种设置中使用的电流 - 电压转换器与电阻反馈。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 水平硐室的温度控制。显示的Langendorff的建立，其中完整的心保持功能小时的图。心脏被绑定到一个针头，通过它所有的解决方案和染料通过冠状动脉妖异的主动脉的复古灌注到心脏。腔室位于上方的珀尔帖单元以保持浴，这是由连接到伏特计的温度传感器读取的温度。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5： 在完整的心脏跨壁动作电位测量。 （ 一 ）动作电位持续时间（APD）被评估，因为它需要完成30％，70％，或90％的AP复极时间。 （b）从所述心外膜（黑色）和心内膜（灰色）二- 8-ANEPPS荧光显示AP心室壁的两层之间在复极化的形态差异。 （ 三 ）评估to后他APD 30，70，90心内膜和心外膜，结果显示，只有显著差异发生在APD 30（8±2.5毫秒内膜比3±0.6毫秒心外膜）。心脏在6赫兹节奏和温度设定为37℃。数据是平均5心中±SEM。 * P <0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6： 跨壁钙 在完整的心瞬时测量。 （ 一 ）的Ca参数2+测量瞬变动力学是：所花费的时间，以达到最大，达峰时间（TP）;它从10％去上升的90％以上的时间，上升时间（RT）;它需要去从10％到衰减，衰减时间（DT）的90％的时间;和花费的时间来完成的过渡，半持续时间（HD）的50％。 （b）用绿色CW激光表演外膜（黑色）和心内膜（灰色） 钙瞬变与放松差别激励后RHOD 2发出的荧光。 三 ）钙从心内膜2+瞬变过在室温，TP高清显著较慢动力学和DT比那些从心外膜记录。心脏在6赫兹节奏和温度设定为37℃。数据是平均5心中±SEM。 * P <0.05。从Mattiazzi 等进行修改。 15。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7：SR 内钙离子在完整心脏测量。（ 一 ）从MAG-的Fluo-4染料发射的荧光降低随着时间的推移，这反映在帧内的SR Ca 2+浓度的降低。 （b）如幅度-的Fluo 4荧光指示的 Ca 2+耗竭通过从SR 的 Ca 2+释放引起的减少的放大图。 （c）约幅度-的Fluo 4荧光代表的 Ca 2+释放由灌流用20mM咖啡因心改性瞬时振幅的下降的展开图。 （ 四 ）咖啡因的一个长的应用，无论是在钙瞬变[降至92±0.05％（N = 4，P = 0.012）和的幅度的幅度-的Fluo-4的荧光和舒张水平下降之后51±0.21％（N = 4，P = 0.003）的初始值，分别]，观察到。随着越来越多的时间从咖啡因的进行，更小的是将SR耗尽的幅度。 （ 五 ）在BD标准化的痕迹表明，SR消耗不仅导致S减少钙离子信号的同时也减慢SR 钙补充。心在4赫兹节奏和温度设定为37℃。荧光轨迹是从Kornyeyev 等。 16。 请点击此处查看该图的放大版本。
图8： 在完整的心与脉冲LED AP的比例测量。 （ 一 ），包括整合和探头的复位的时序图，通断LED和实际的记录的次数中示出。 （ 二 ）跟踪来自两个信道具有不同静息的值，并且由直到每个AP是由一个静止值之前移动所述杆校正的偏移。每个通道的增益也adjus特德。需要注意的是出现在这两个之间的去极化两个通道的一个非常大的运动伪影。软件ratiometrically处理信号后，其结果是没有明显的伪像（蓝色）的AP。心脏在3赫兹节奏，温度设定为28℃。显示的所有记录的10痕迹的平均值。 请点击此处查看该图的放大版本。
图9： 同时钙瞬变并与脉冲LED完整的心AP测量。信号的串扰污染记录当两个钙离子和AP可以在网上进行校正。该电位染料，二-8-ANEPPS，很高兴有20μs的蓝色LED脉冲（A）。信号有sPLIT，过滤与带通红色和绿色过滤器。这些信号被表示为红色（b）和绿色通道（c）两个不同的雪崩光电二极管检测到。它是可以观察到两个信号，红色和绿色，呈现显示为向下偏转明显运动伪影。两个信号，红色和绿色，被offseted然后扩增。该调节的信号被用来计算它们之间的比例，结果在D所示。能够观察到，在移动工件被取消这两个信号（D）之间的比率。图E示出了控制一个绿色发射LED用于激发的 Ca 2+指示剂RHOD -2-逻辑脉冲序列。使用该方法得到的荧光信号示于F。虽然f中的跟踪大多示出了荧光信号的增加是由于钙离子结合蛋白g至RHOD-2，但也可以观察到在跟踪一个负偏转由于从二 - 8-ANEPPS荧光检测的信号时，这种染料是激发绿色光。这个问题可以通过减去以g所示的电位信号进行校正。减法的结果示于面板h式一钙 的获得的AP污染信号免费。心脏在3赫兹节奏，温度设定为28℃。显示的所有记录的10痕迹的平均值。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
本文在描述局部场荧光技术来评估心肌细胞体外的功能中心。这些细胞在耦合环境的研究不仅更加生理，但也是高度适宜用于评估器官级病状。底层兴奋-收缩偶联（ECC）的蜂窝事件可以在与使用监测细胞内Ca 2+动力学分子探针的整个器官水平进行评估（RHOD 2细胞内的Ca 2+，幅度- Fluo4 SR的Ca 2+）和电活动（二 - 8-ANEPPS）。这里，我们已经提出了三种LFFM萤光技术，既激发和收集从利用光纤的荧光指示器的排放。它们之间的区别基于所使用的光源和光调制的类型。的PLFFM使用该脉冲光，CLFFM采用连续激光的激光，而LEDFM使用可也可以在PLEDFM脉冲的LED。所有的这些在图1中作为一个集合给出，但可以只用三个萤光装置之一来构建。此外，所检测的光可以以不同的方式进行处理。例如， 图2示出了光电流可以是集成的或由一个电流-电压转换器的装置，直接转换为电压两种不同的情况。在一般情况下，LFFM方法可用于同时测量多个解剖位置，如图为图3。
这里提出了在完整器官水平评估心脏性能的方法更充分研究的问题，其中的细胞之间的结合是在定义的组织的行为的关键。心脏的固有不均匀性可以产生不同的AP基于特定组织波形13，21，22从该策LLS产生。因此，整个器官的研究提供了机会，以评估不同的解剖结构的小区的本地生理功能。此外，我们已经看到，像火花和海浪细胞内事件有游离细胞不同动力学较完好的器官15。
所述的Langendorff的建立（ 图4）是在一种情况就是接近体内维持心脏的关键。此外，它允许多种药物和各种荧光分子探针，使一些生理参数的测量逆灌注。改变所使用的外源性荧光探针，增加了光纤的大小，或选择不同的光源可显着地改变了该技术的应用。此外，在水平腔室下方的珀尔帖单元能够促进钙动力学在不同温度下的研究。添加配件到LFFM诸如分束器可以增加用于从不同的区域在完整心脏记录光纤的数目。这是，如果地区差异出现在病理情况下，测试一个非常有用的改编。 图3示出了心内膜和心外膜被同时评估。此外，不同的受体激动剂灌注心脏可以让我们了解如何在心室壁的不同区域进行调节。电气信号（ 图5）和Ca 2+动力学（ 图6）的非均质性可以在外膜和心内膜进行比较。此外，可以使用具有不同的激发波长和发射滤光片多种染料。例如，通过使用幅度-的Fluo-4，SR的管腔的 Ca 2+水平可以被记录（ 图7）。改变光纤的大小也可以通过使所述荧光记录从拉尔延长该方法的能力蒙古包区域。
本文还表明，除了昂贵的激光器，发光二极管可以被用作在我们的技术的激发光源。 图8显示，这种廉价型光源可用于ratiometrically测量的AP。在图8所示的比率量度测量是生产没有实验的工件，包括那些因移动一个最终的记录是有利的。最后，即使所述的 Ca 2+瞬变和AP可以光学地记录，同时，通过多路复用不同的波长，并使用染料以相同的发射光谱。的信号在图9中所概述的处理是除去在染料的发射光谱的重叠产生的内部污染的关键。录制钙瞬变和接入点，同时，但作为两个独立的输出信号是在研究ECC和钙离子诱导的Ca 2+有利
LFFM是在完整的组织的细胞生理学多个应用程序的技术。然而，一个主要的限制是所记录的荧光发射的来自于局部区域，其中该光纤是在与组织接触的底层荧光指标的平均值。使用两个光纤即使当，LFFM不提供测量信号的一个亚细胞空间分布。光学映射是用于监视在空间和时间，例如在AP， 钙瞬变的传播改变生理变量一个更好的技术，和交替23，24，25。 LFFM也无法提供结构的成像，例如共焦显微镜等光学映射技术。然而，它的使用光纤使得它在r中实际ECORDING从心内膜或难以或不可能在一个完整的心脏用共聚焦显微镜获得的其他地区的地方荧光信号。
从完整心脏获得生理变量之间，并从分离的心肌细胞的实验的比较是富有挑战性的。用分离的心肌细胞的最大优点是评价膜片钳的条件下的细胞的生物物理特性的独特的机会。相比之下，LFFM允许的生理，病理现象更原生环境的研究。例如，在完整的心我们可以评估透差异15，AP和钙的心脏速率依赖性2+在生理范围13是在分离的细胞达不到的。另外，我们可以研究的完整心脏9,10的功能的缺血损伤的影响。整个心脏前periments也允许我们评估其它类型的细胞和心肌细胞11之间的相互作用。
LFFM允许蜂窝信号中的，其中细胞具有生理耦合完整心脏水平可视化。 LFFM允许胞内活性的研究，而细胞仍然在完整器官。在用荧光染料和epiluminescence组合，LFFM可以监视两个关键心脏属性： 钙动力学和电活动。
最后，这里提出的方法可以在ECC的研究多个应用程序。它是一个工具，揭示了如何超分子信号在病理情况下都受影响，如心律失常16和缺血9,15。这种技术是必须的，以研究这些病症，因为它们只能在完整器官水平来理解。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢艾丽西亚Mattiazzi博士所提出的工作提出了批评讨论。这项工作是由美国国立卫生研究院从赠款（R01 HL-084487），以支持ALE。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
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