Analyse van celsuspensies Geïsoleerd van vaste weefsels door Spectral flowcytometrie
Summary
Dit artikel beschrijft spectrale cytometry, een nieuwe benadering flowcytometrie dat de vormen van emissiespectra gebruikt om fluorochromen onderscheiden. Een algoritme vervangt vergoedingen en kan de behandeling van auto-fluorescentie als een onafhankelijke parameter. Deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk voor een juiste analyse van de cellen geïsoleerd van vaste organen.
Abstract
Flowcytometrie is gebruikt voor de afgelopen 40 jaar te definiëren en analyseren van het fenotype van lymfe en andere hematopoietische cellen. Aanvankelijk beperkt tot de analyse van enkele fluorochromen, momenteel zijn er tientallen verschillende fluorescente kleurstoffen en tot 14-18 verschillende kleurstoffen kunnen worden gecombineerd tegelijk. Echter, een aantal beperkingen belemmeren nog steeds de analytische mogelijkheden. Door de veelheid van fluorescerende probes is gegevensanalyse steeds complexer geworden vanwege de noodzaak van grote multi-parametrische compensatie matrices. Bovendien hebben mutante muismodellen uitvoering fluorescerende eiwitten op te sporen en sporen specifieke celtypen in verschillende weefsels beschikbaar komen, zodat de analyse (met flowcytometrie) van auto-fluorescentie celsuspensies verkregen vaste organen nodig. Spectraal flowcytometrie, die het vormen van emissiespectra onderscheidt langs een groot aantal continue golflengten, wordt een aantal van deze problemen. De gegevens worden geanalyseerd wMet een algoritme dat compensatiematrices vervangt en automatisch fluorescentie behandelt als een onafhankelijke parameter. Derhalve zou spectrale stromingscytometrie in staat zijn om fluorkromen te onderscheiden met vergelijkbare emissietoppen en kan een multi-parametrische analyse bieden zonder compensatievereisten.
Dit protocol beschrijft de spectrale flowcytometrie analyse, waardoor een 21-parameter (19 fluorescerende probes) karakterisering en het beheer van een auto-fluorescerend signaal, die hoge resolutie bieden bij kleine populatie detectie. De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat spectraal stromingscytometrie voordelen biedt in de analyse van celpopulaties uit weefsels die moeilijk zijn om te karakteriseren in conventionele stromingscytometrie, zoals het hart en de darm. Spectrale stromingscytometrie demonstreert aldus de multi-parametrische analytische capaciteit van conventionele stromingscytometrie met hoge prestaties zonder de vereiste compensatie en maakt het mogelijk om fluorescentie te beheersen.
Introduction
In de afgelopen decennia, flowcytometrie (FCM) werd op grote schaal beschikbaar analytische methode van essentieel belang voor mobiele phenotyping studies. Er is een aanzienlijke verhoging van de beschikbare fluorescerende kleurstoffen, fluorochromen bijzonder aangeslagen door de violette laser (405 nm) (bijvoorbeeld Brilliant Violet en nieuwe Q-dot kleurstoffen) zijn. Echter, de groei van de beschikbare fluorescerende kleurstoffen verhoogt het risico van overlappende emissies en vergt arbeidsintensieve compensatie matrices. FCM werd op grote schaal gebruikt om celsuspensies van vast weefsel te analyseren, maar de aanwezigheid van auto-fluorescerende cellen beperkt de discriminatie van specifiek gelabeld populaties.
De basisprincipes van spectrale FCM worden in detail Futamura et al. 1, 2. In het kort wordt de spectrale FCM hier gebruikt (zie de tabel van materialen) voorzien van 405, 488 en 638 nm lasers. De spectrale FCM vangt de uitgezonden fluorescence spectra als een 32-kanaals lineaire reeks PMT (32ch PMT) van 500 nm tot 800 nm en 2 onafhankelijke PMT van 420 nm tot 440 nm en 450 nm tot 469 nm, respectievelijk, die de gebruikelijke bandfilters vervangen. De 488 en 405/638 nm laserspots ruimtelijk gescheiden, terwijl de 405 nm en 638 nm laserspots co-lineair. Voor elk individueel deeltje, de spectrale FCM meet tot 66 kanalen van fluorescentie data opgewekt door de 405 nm en 488 nm lasers. Wanneer cellen worden geëxciteerd door de 638 nm laser, spectrale FCM van 58 kanalen van fluorescentie gegevens omdat een masker wordt geplaatst om te voorkomen dat de 638 nm laser schijnen in de PMT. Spectrale FCM analyseert het volledige spectrum verkregen data met een algoritme op basis van de gewogen kleinste kwadraten methode (WLSM), waarbij de scheiding van overlappende fluorescentiespectra mogelijk maakt. Spectra verkregen uit één gekleurde en ongekleurde monsters worden als de basis referentiespectra. Multi-gekleurd monsters mathematisch aangebracht eennd onvermengd, en het spectrum van een monster met gemengde fluorescerende labels wordt ontleed in een verzameling van de samenstellende spectra. De ontmenging, spectrale techniek 3, 4, vervangt de vergoeding die het signaal van alle detectoren behalve het meten van een bepaalde kleurstof verwijderd.
In deze studie hebben we gecombineerd en getest 19 fluorochromen in één 21-parameteranalyse dat het grootste hematopoietische subsets in de muis milt kenmerk. Daarnaast hebben we aangetoond dat de spectrale cytometrie auto-fluorescerende signaal kan beheren, waardoor de karakterisering van intestinale intra-epitheliale lymfocyten en van het embryonale hart te verbeteren. Inderdaad, in deze weefsels, auto-fluorescentie beheer toegestaan voor de toewijzing van specifieke fluorescentie om cellen die uit de analyse in conventionele FCM zouden worden uitgesloten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gebruikelijke FCM is gebaseerd op de detectie van fotonen uitgezonden na excitatie van fluorescerende probes. De fluorescentie emissie van één fluorochroom gedetecteerd in een detector ontworpen om het signaal van een andere fluorochroom meten induceert fysische overlap. Dit spillover onder emissiespectra moet worden gecorrigeerd door compensaties.
Spectrale FCM en gegevensverwerking door de ontmenging deconvolutie-algoritme maakt de combinatie van fluorochromen die nauwe emissiepieken zon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen de technische en theoretische bijdragen in spectrale cytometrie van K. Futamura, die ook kritisch het manuscript herzien. We zijn ook dank verschuldigd aan C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, en P. Pereira voor het kritisch lezen van het manuscript en voor eindeloze technisch advies en ondersteuning. We danken ook P. Pereira voor de gave van de anti Vγ7-APC en Vδ4-biotine gelabelde antilichamen. We aknowledge het Centre d'Enseignements van Pasteur Instituut voor gastvrij en het ondersteunen van het filmen logistiek. Dit werk werd ondersteund door het Instituut Pasteur, het Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); de Swiss National Science Foundation en Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia – SFRH / BD / 74218/2010 (MV); en Université Paris Diderot, het Agence Nationale de la Recherche (ANR) project Twothyme, de ANR, en Program REVIVE (investering voor de toekomst) (AC).
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. “String theory” of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
