ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי
Summary
מאמר זה מתאר ספקטרלי cytometry, גישה חדשה ב cytometry הזרימה המשתמשת צורות של ספקטרום פליטה להבחין fluorochromes. אלגוריתם מחליף פיצויים יכול לטפל קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי. גישה חדשה זו מאפשרת הניתוח הראוי של תאים מבודדים איברים מוצקים.
Abstract
Cytometry זרימה שמש במשך 40 השנים האחרונות כדי להגדיר ולנתח את הפנוטיפ של הלימפה ותא hematopoietic אחר. בתחילה מוגבל הניתוח של כמה fluorochromes, כיום ישנם עשרות צבעי ניאון שונים, ועד 14-18 צבעים שונים ניתן לשלב בכל פעם. עם זאת, מספר מגבלות עדיין לפגום ביכולות אנליטיות. בגלל ריבוי בדיקות ניאון, ניתוח נתונים הפך מורכב יותר ויותר בשל הצורך של מטריצות פיצוי גדול, רב-פרמטריים. יתר על כן, מודלי עכבר מוטצית נושאת חלבוני ניאון כדי לזהות ולאתר את סוגי תאים ספציפיים ברקמות שונות הפכו זמינים, כך הניתוח (על ידי cytometry זרימה) של השעיות תא-ניאון אוטומטי המתקבלות איברים מוצקים נדרש. Spectral cytometry זרימה, אשר מבדיל את הצורות של ספקטרום פליטה יחד מגוון רחב של אורכי גל מתמשך, כמה כתובות של בעיות אלה. הנתונים נותחו wה- i אלגוריתם המחליפה מטריצות פיצוי ומטפל קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי. לפיכך, cytometry הזרימה ספקטרלי צריך להיות מסוגל להפלות fluorochromes עם פסגות פליטה דומה והוא יכול לספק ניתוח רב-פרמטרי ללא דרישות פיצוי.
פרוטוקול זה מתאר את זרימת ספקטרלי ניתוח cytometry, המאפשר אפיון 21-פרמטר (19 בדיקות ניאון) לבין הנהלת אות אוטומטית פלורסנט, מתן ברזולוציה גבוהה לגילוי אוכלוסיית קטין. התוצאות המוצגות כאן מראות כי זרימת ספקטרלי cytometry מציגה יתרונות בניתוח של אוכלוסיות תאים מרקמות קשות לאפיין בזרימה קונבנציונלית cytometry, כגון לב והמעי. Spectral cytometry זרימה ובכך מדגים את יכולת אנליטית רבה-פרמטרית של זרימה קונבנציונלית בעלות ביצועים גבוהה cytometry ללא דרישה לפיצוי ומאפשר ניהול האוטומטי פלואורסצנטי.
Introduction
בעשורים האחרונים, cytometry הזרימה (FCM) הפכתי שיטה אנליטית נפוצה חיונית ללימודי phenotyping התא. יש כבר עלייה משמעותית צבעי ניאון זמין, במיוחד fluorochromes נרגש לייזר סגול (405 ננומטר) (למשל, ויולט מבריק וצבעים Q-נקודה חדשה). עם זאת, הצמיחה של צבעי ניאון זמינים מגבירה את הסיכון של פליטה חופפת ודורשת מטריצות פיצוי עתירת עבודה. FCM הפך בשימוש נרחב כדי לנתח השעיות תא מרקמה מוצקה, אבל הנוכחות של תאי-ניאון אוטומטי מגבילה את האפליה של אוכלוסיות מוגדרות מפורש.
העקרונות הבסיסיים של ספקטרלי FCM מדווחים בהרחבת Futamura ואח. 1, 2. בקצרה, FCM ספקטרלי משמש כאן (ראו טבלה של חומרים) מצוידת 405, 488, ו 638 nm לייזרים. ה- FCM ספקטרלי לוכד את כל f הנפלטluorescence כמו ספקטרום בתוך (PMT 32ch) PMT מערך ליניארי 32 ערוצים עבור 500 ננומטר ל 800 ננומטר ו 2 PMTs עצמאית עבור 420 ננומטר ל 440 ננומטר ו 450 ננומטר ל 469 ננומטר, בהתאמה, אשר תחליף את מסנני להקה עוברת הקונבנציונליים. 488 ואת המקומות לייזר 405/638 ננומטר מופרדים מרחבית, ואילו כתמים לייזר 405 ננומטר ו 638 ננומטר הם שיתוף ליניארי. עבור כל חלקיק בודד, אמצעי FCM ספקטרלי עד 66 ערוצים של נתוני קרינה נרגש 405 ננומטר ו 488 ננומטר לייזרים. כאשר תאים שמחים על לייזר 638 ננומטר, ה- FCM ספקטרלי מודד 58 ערוצי נתוני הקרינה בגלל מסכה מוכנס למנוע לייזר 638 ננומטר מן שהאירו את PMT. Spectral FCM מנתחת את נתוני מלוא הספקטרום רכשו עם אלגוריתם המבוסס על שיטת הריבועים הפחותה המשוקללת (WLSM), אשר מאפשרת הפרדה של חופפי ספקטרום ניאון. ספקטרה נגזרה דגימות יחידות מוכתמות unstained מוכרת כמו ספקטרום ההתייחסות הבסיסי. דגימות Multi-צבעוניות מותקנות באופן מתמטיnd צרוף, ואת הספקטרום של מדגם עם תוויות ניאון מעורבות מפורק לתוך אוסף של ספקטרה המרכיב אותה. Unmixing, בטכנולוגיה רפאים 3, 4, מחליף את הפיצוי אשר מסיר את האות מכל גלאי פרט אחד למדידת צבע נתון.
במחקר זה, אנו בשילוב ונבדקנו 19 fluorochromes בניתוח יחיד, 21-פרמטר שאפיין את תת hematopoietic הגדולה נמצאת טחול העכבר. בנוסף, הראינו כי cytometry ספקטרלי יכול לנהל אות אוטומטית פלורסנט, ובכך לשפר את האפיון של לימפוציטים תוך האפיתל במעי ואת הלב העוברי. ואכן, ברקמות אלה, ניהול אוטומטי קרינה מוותר המשימה של קרינה ספציפית לתאים כי יהיו מהאנליזה ב קונבנציונלי FCM.
Protocol
Representative Results
Discussion
FCM הקונבנציונלי מבוסס על זיהוי של פוטונים הנפלטים לאחר העירור של בדיקות ניאון. פליטת הקרינה של fluorochrome אחד זוהה גלאי שנועד למדוד את האות מ fluorochrome אחר גורמת חפיפה פיזית. זליגה זה בין ספקטרום פליטה צריכה להיות מתוקנת על ידי פיצויים.
F…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים את התרומות הטכניות תיאורטיות ב cytometry ספקטרלי של ק Futamura, שגם מתוקן באופן ביקורתי את כתב היד. אנחנו גם חבנו ג איט-מנצור, P.-H. Commere, א Bandeira, ו פ פרירה לקריאה ביקורתית את כתב היד ואת לקבלת ייעוץ טכני אינסופי ותמיכה. אנו מודים גם פ פרירה על המתנה של נוגדני Vγ7-APC ו Vδ4-ביוטין שכותרתו אנטי. אנחנו aknowledge המרכז d'Enseignements ממכון פסטר עבור מסבירת פנים בתמיכה לוגיסטית הצילומים. עבודה זו נתמכה על ידי מכון פסטר, Institut National de la Santé et de la משוכלל ונדיר Medicale (INSERM); קרן המדע הלאומי השוויצרי ו Roux Bourse פסטר (SS); Fundação para EA Ciencia Tecnologia – SFRH / BD / 74218/2010 (MV); ו אוניברסיטת פריז דידרו, הפרויקט סוכנות הידיעות הלאומית de la משוכלל ונדיר (ANR) Twothyme, את ANR, ואת תוכנית להחיות (השקעה לעתיד) (AC).
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. “String theory” of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
