Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi
Summary
Bu makalede, sitometrisi spektral, fluorochromes ayırt emisyon spektrumları şekilleri kullanan akış sitometrisi yeni bir yaklaşım tarif edilmektedir. Bir algoritma, tazminat değiştirir ve bağımsız bir parametre olarak otomatik floresan tedavi edebilir. Bu yeni yaklaşım, katı organ izole edilmiş hücre uygun analizi sağlar.
Abstract
Akış sitometrisi tanımlar ve lenfoid ve diğer hematopoietik hücrelerin fenotipinin analiz etmek için, son 40 yıldır kullanılmaktadır. Başlangıçta birkaç fluorochromes analizi ile sınırlı, şu anda farklı floresan boyalar düzinelerce vardır ve en fazla 14-18 farklı boyalar bir anda birleştirilebilir. Ancak, çeşitli sınırlamalar hala analitik yeteneklerini bozar. Çünkü floresan probları çokluğu, veri analizi nedeniyle büyük, çok parametre dengeleme matrislerinin ihtiyaç giderek daha karmaşık hale gelmiştir. Katı organlar elde edilen otomatik flüoresan hücre süspansiyonları (akış sitometrisi ile) analizi gereklidir, böylece Ayrıca, tespit etmek ve farklı dokularda spesifik hücre tipleri iz floresan proteinleri taşıyan mutant fare modelleri, mevcut hale gelmiştir. Sürekli dalga boylarında çok geniş bir aralık boyunca emisyon spektrumları şekil ayıran, akış sitometrisi Spektral, bu problemlerin bir kısmını ortadan kaldırır. Veri ağırlık incelendiğindedengeleme matrisleri yer değiştirir ve bağımsız bir parametre olarak otomatik floresan tedavi eden bir algoritma i. Bu nedenle, spektral akış sitometri benzer emisyon tepe noktalarıyla fluorochromes ayırt etme yeteneğine sahip olmalıdır ve dengeleme şartları olmadan multi-parametrik analiz ortaya koyar.
Bu protokol küçük nüfus tespiti yüksek çözünürlük sağlayan bir 21-parametresi (19 floresan probları) karakterizasyonu ve bir oto-floresan sinyalinin yönetimi sağlayan, sitometri analizi spektral akışını açıklar. Burada sunulan sonuçlar, spektral akış sitometri gibi kalp ve bağırsak gibi sitometri geleneksel akış karakterize edilmesi zor dokular, hücre popülasyonlarının analizi avantaj sunar göstermektedir. sitometrisi böylece akış tazminat gereksinimi olmadan sitometrisi geleneksel akışını ve performansı yüksek ve sağlayan otomatik floresan yönetiminin çok parametrik analitik kapasitesini gösteriyor Spektral.
Introduction
Son birkaç on yılda, akış sitometrisi (FCM) hücre fenotiplendirme çalışmaları için gerekli bir yaygın kullanılan analitik yöntem haline geldi. Özellikle mor lazer (405 nm) (örneğin, parlak mor ve yeni Q-nokta boyalar) ile uyarıldığında, florokromlar mevcut floresan boyalar olarak önemli bir artış, olmuştur. Ancak, mevcut floresan boyalar büyüme örtüşen emisyon riskini artırır ve emek yoğun tazminat matrisleri gerektirir. FCM katı bir doku hücre süspansiyonları analiz etmek için yaygın olarak kullanılan oldu ama otomatik floresan hücrelerinin varlığı, spesifik olarak etiketlenmiş popülasyonlarının ayrımı sınırlar.
Spektral FCM temel ilkeleri Futamura ve ark detaylı olarak bildirilmektedir. 1, 2. Kısaca, burada kullanılan spektral FCM (malzemelerin tabloya bakınız) 405, 488 ve 638 nm lazer ile donatılmıştır. spektral FCM tüm yayılan f yakalar800 nm, 500 nm ve geleneksel bant-geçişli filtreler yerine 420 nm sırasıyla nm ila 469 nm ila 440 ve 450 için 2 bağımsız PMT'lerin için 32 kanallı bir doğrusal dizi PMT (32CH PMT) içerisinde spektrumları olarak luorescence. 405 nm ve 638 nm lazer noktaları eş-doğrusal ise 488 ve 405/638 nm lazer noktaları uzamsal ayrılır. her bir parçacık için, 405 nm ile uyarılmış floresan veri 66 kanal ve 488 nm lazer kadar spektral FCM ölçer. Hücreler 638 nm lazeri tarafından uyarılır ne zaman bir maske PMT bir parlamasını 638 nm lazer önlemek için yerleştirildiği için, spektral FCM floresan veri 58 kanal ölçer. Spektral FCM floresan spektrumu örtüşen ayrılmasını sağlayan ağırlıklı en küçük kareler metodu (WLSM), temel bir algoritma ile elde edilen tam bir spektrum analiz eder. -Tek boyanmış ve boyanmamış numunelerden türetilen Spectra temel referans spektrumları olarak kabul edilmektedir. Çok lekeli örnekler matematiksel monte edildiği birkarışmamış ve karma floresan etiketler ile bir numunenin spektrumu nd kurucu spektrumları bir koleksiyonu halinde ayrıştırılır. Karışmama, spektral teknoloji 3, 4, belirli bir boya ölçüm dışındaki tüm detektör sinyali çıkarır tazminat yerini alır.
Bu çalışmada, bir araya getirilmiş ve fare dalağı içinde bulunan başlıca hematopoietik alt kümelerini, özelliği, tek bir 21-parametre analizi 19 fluorochromes test edilmiştir. Buna ek olarak, spektral sitometrisi ve böylece bağırsak intraepitelyal lenfositlerin ve embriyonik kalp karakterizasyonu iyileştirilmesi, otomatik floresan sinyali yönetebilir göstermiştir. Gerçekten de, bu dokularda, otomatik floresans yönetimi geleneksel FCM analiz dışlanacaklarını hücrelerine spesifik flöresan belirlenmesini mümkün kılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geleneksel FCM floresan probları uyarma sonra yayılan foton tespitine dayanmaktadır. Başka bir florokrom sinyalin yoğunluğunu ölçmek için tasarlanmış bir detektörde tespit edilir, bir fluorokrom floresans emisyon fiziksel örtüşme indükler. emisyon spektrumları arasında bu yayılma tazminatlar tarafından düzeltilmesi gerekiyor.
Karışmama ters evrişim algoritması tarafından spektral FCM ve veri işleme farklı spektral şekle sahip olması koşuluyla, ek ödeme olmaks?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Makaleyi eleştirel olarak revize eden K. Futamura'nın spektral sitometride teknik ve teorik katkılarını kabul ederiz. Ayrıca C. Ait-Mansour'a borçluyuz, P.-H. El yazmasını eleştiren okumak ve sonsuz teknik tavsiye ve destek için Commere, A. Bandeira ve P. Pereira. Ayrıca, anti Vγ7-APC ve Vδ4-Biyotin etiketli antikorların armağanı için P. Pereira'ya teşekkür ediyoruz. Pasteur Enstitüsü'ndeki Merkezi Enstitüleri, film lojistiğini karşılamak ve desteklemek için biliyoruz. Bu çalışma, Pasteur Enstitüsü, Institut National de la Santé de la Recherche Médicale (INSERM) tarafından desteklenmiştir; İsviçre Ulusal Bilim Vakfı ve Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia – SFRH / BD / 74218/2010 (MV); Ve Université Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR) projesi Twothyme, ANR ve Program Yükseltme (Geleceğe Yatırım) (AC).
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. “String theory” of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
