تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي
Summary
توضح هذه المقالة الطيفية الخلوي، نهجا جديدا في التدفق الخلوي يستخدم الأشكال من أطياف الانبعاث للتمييز fluorochromes. خوارزمية استبدال التعويضات ويمكن علاج لصناعة السيارات في مضان كمعلمة مستقلة. يسمح هذا النهج الجديد لتحليل سليم للخلايا معزولة من الأعضاء الصلبة.
Abstract
التدفق الخلوي قد استخدمت على مدى السنوات ال 40 الماضية لتحديد وتحليل النمط الظاهري للاللمفاوية والخلايا المكونة للدم الأخرى. يقتصر في البداية على تحليل عدد قليل من fluorochromes، وحاليا هناك العشرات من الأصباغ الفلورية مختلفة، وتصل إلى 14-18 الأصباغ المختلفة يمكن الجمع في وقت واحد. ومع ذلك، لا يزال العديد من القيود يضعف القدرات التحليلية. ونظرا لتعدد تحقيقات الفلورسنت، أصبح تحليل البيانات تزداد تعقيدا بسبب حاجة كبيرة، المصفوفات تعويضات متعددة حدودي. وعلاوة على ذلك، أصبحت نماذج الماوس متحولة تحمل البروتينات الفلورية لكشف وتتبع أنواع معينة من الخلايا في الأنسجة المختلفة المتاحة، لذلك مطلوب تحليل (عن طريق التدفق الخلوي) من تعليق خلية لصناعة السيارات الفلورسنت تم الحصول عليها من الأعضاء الصلبة. الطيفي التدفق الخلوي، والذي يميز الأشكال الأطياف الانبعاثات على مجموعة واسعة من موجات مستمرة، يعالج بعض من هذه المشاكل. ويتم تحليل البيانات ثإيث خوارزمية الذي يحل محل المصفوفات التعويض ويعامل صناعة السيارات في مضان كمعلمة مستقلة. وبالتالي، يجب أن يكون الطيفي التدفق الخلوي قادرة على التمييز fluorochromes مع قمم الانبعاثات مماثلة، ويمكن أن توفر تحليل متعدد حدودي دون متطلبات التعويض.
يصف هذا البروتوكول تدفق الطيفي الخلوي التحليل، والسماح لمعلمة 21 (19 تحقيقات الفلورسنت) توصيف وإدارة إشارة لصناعة السيارات الفلورسنت، وتوفير عالية الدقة في كشف سكان القصر. أظهرت النتائج المعروضة هنا أن تدفق الطيفي يعرض الخلوي المزايا في تحليل للسكان الخلية من الأنسجة يصعب تميز في التدفق التقليدي الخلوي، مثل القلب والأمعاء. الطيفي التدفق الخلوي وبالتالي يدل على القدرة التحليلية متعددة حدودي من إدارة التدفق التقليدي الخلوي دون الحاجة للحصول على تعويضات عالية الأداء ويمكن لصناعة السيارات في مضان.
Introduction
في العقود القليلة الماضية، التدفق الخلوي (FCM) أصبحت وسيلة تحليلية على نطاق واسع أساسيا للدراسات خلية phenotyping. كان هناك زيادة كبيرة في الأصباغ الفلورية المتاحة، وخاصة fluorochromes ولع الليزر البنفسجي (405 نانومتر) (على سبيل المثال، البنفسج الرائعة والأصباغ الجديدة-Q نقطة). ومع ذلك، فإن نمو الأصباغ الفلورية المتاحة يزيد من خطر الانبعاثات المتداخلة ويتطلب المصفوفات تعويض كثيفة العمالة. أصبح FCM المستخدمة على نطاق واسع لتحليل تعليق خلية من الأنسجة الصلبة، ولكن وجود خلايا لصناعة السيارات الفلورسنت يحد من التمييز ضد السكان المسمى على وجه التحديد.
ويقال إن المبادئ الأساسية للالطيفي FCM بالتفصيل في Futamura وآخرون. 1، 2. لفترة وجيزة، وقد تم تجهيز FCM الطيفية المستخدمة هنا (انظر الجدول المواد) مع 405، 488، و 638 ليزر نانومتر. وFCM الطيفي يلتقط جميع و المنبعثluorescence كما الأطياف في 32 قناة خطي مجموعة PMT (32CH PMT) مقابل 500 نانومتر إلى 800 نانومتر و 2 هذه الفرق المستقلة عن 420 نانومتر إلى 440 نانومتر و 450 نانومتر إلى 469 نانومتر، على التوالي، والتي تحل محل مرشحات الفرقة تمرير التقليدية. يتم فصل وبقع الليزر 488 نانومتر 405/638 مكانيا، في حين أن البقع الليزر 405 نانومتر و 638 نانومتر هي شارك في الخطية. لكل الجسيمات الفردية، والتدابير FCM الطيفية ما يصل الى 66 قنوات من البيانات مضان متحمس من قبل نانومتر 405 و 488 نانومتر الليزر. عندما متحمس الخلايا عن طريق نانومتر الليزر 638، وFCM الطيفي يقيس 58 قنوات من البيانات مضان لإدخال قناع لمنع الليزر 638 نانومتر من ساطع في PMT. الطيفية FCM يحلل البيانات الطيف الكامل المكتسبة مع خوارزمية على أساس مرجح طريقة المربعات الصغرى (WLSM)، والتي تمكن فصل تداخل الأطياف الفلورسنت. يتم التعرف على أطياف مستمدة من عينات واحدة الملطخة وغير ملوثين كما أطياف المرجع الأساسي. تم تركيب عينات متعددة الملون رياضيا لوتتحلل الثانية غير مخلوطة، وطيف من عينة مع تسميات فلوري مختلطة إلى مجموعة من الأطياف المكونة لها. وunmixing، في التكنولوجيا الطيفية 3، 4، محل التعويض التي تزيل إشارة من جميع أجهزة كشف ما عدا واحدة قياس صبغة معينة.
في هذه الدراسة، ونحن معا واختبار 19 fluorochromes في واحد، وتحليل 21 المعلمة التي اتسمت بها مجموعات فرعية للدم الرئيسية الموجودة في الطحال الماوس. بالإضافة إلى ذلك، أثبتنا أن الخلوي الطيفي يمكن إدارة إشارة لصناعة السيارات الفلورسنت، وبالتالي تحسين خصائص الخلايا الليمفاوية المعوية داخل الظهارية ومن القلب الجنينية. في الواقع، في هذه الأنسجة، وإدارة صناعة السيارات في مضان سمحت لهذه المهمة من مضان محددة للخلايا التي ستستبعد من التحليل في FCM التقليدية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويستند FCM التقليدية للكشف عن الفوتونات المنبعثة بعد إثارة تحقيقات الفلورسنت. انبعاث مضان من تألقي واحدة في الكشف عن جهاز كشف لقياس إشارة من تألقي آخر يدفع التداخل المادي. هذا امتداد بين أطياف الانبعاث يحتاج إلى تصحيحها عن طريق التعويضات.
<p class="jove_content" style=";text-align:right;…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف المساهمات التقنية والنظرية في الخلوي الطيفي للK فوتامورا، الذي أيضا مراجعة نقدية للمخطوطة. ونحن أيضا مدينون لC. آيت منصور، P.-H. Commere، A. بانديرا، وP. بيريرا لقراءة نقدية للمخطوطة وللحصول على المشورة التقنية التي لا نهاية لها والدعم. كما نشكر P. بيريرا لهبة المضادة Vγ7-APC وVδ4-البيوتين الأجسام المضادة المسمى. نحن يعترفون والمركز Enseignements من معهد باستور للترحيب ودعم الخدمات اللوجستية التصوير. وأيد هذا العمل من قبل معهد باستور، المعهد الوطني للسانتيه آخرون للبحوث ميديكال (INSERM)؛ مؤسسة العلوم وباستور بورصة رو (SS) الوطني السويسري. فونداساو الفقرة على عصام Ciência بحوث والتكنولوجيا – SFRH / BD / 74218/2010 (MV)؛ وجامعة باريس ديدرو، والوكالة الوطنية للبحوث (ANR) مشروع Twothyme، وكالة الاستخبارات الوطنية، وبرنامج إعادة إحياء (الاستثمار من أجل المستقبل) (AC).
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. “String theory” of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
