Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry
Summary
Dieser Artikel beschreibt, spektrale Zytometrie, einen neuen Ansatz in der Durchflusszytometrie, die die Formen von Emissionsspektren verwendet Fluorochromen zu unterscheiden. Ein Algorithmus ersetzt Kompensationen und kann Auto-Fluoreszenz als unabhängigen Parameter behandeln. Dieser neue Ansatz ermöglicht die korrekte Analyse von soliden Organen isolierten Zellen.
Abstract
Die Durchflusszytometrie wurde in den letzten 40 Jahre zu definieren und den Phänotyp der lymphatischen und anderen hämatopoetischen Zellen zu analysieren. Zunächst beschränkt sich auf die Analyse einiger Fluorochrome, derzeit gibt es Dutzende von unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen und bis zu 14 bis 18 verschiedene Farbstoffe können zu einer Zeit kombiniert werden. Beeinträchtigen jedoch mehrere Einschränkungen noch die analytischen Fähigkeiten. Aufgrund der Vielzahl von Fluoreszenzsonden, hat die Datenanalyse immer komplexer geworden aufgrund der Notwendigkeit von großen, multiparametrisches Kompensations Matrices. Außerdem mutierten Maus-Modelle fluoreszierende Proteine tragen zu detektieren und zu spezifischen Zelltypen in verschiedenen Geweben Spuren verfügbar worden, so dass die Analyse (durch Durchflusszytometrie) von Auto-Fluoreszenz-Zellsuspensionen von festen Organen erhielten erforderlich ist. Durchflusszytometrie Spektral-, welche die Formen von Emissionsspektren entlang einer Vielzahl von kontinuierlichen Wellenlängen unterscheidet, werden einige dieser Probleme. Die Daten werden analysiert, with einen Algorithmus, die Kompensations Matrizen und behandelt Autofluoreszenz als unabhängigen Parameter ersetzt. Somit sollte spektraler Durchflusszytometrie Fluorochrome fähig sein mit ähnlichen Emissionspeaks des Unterscheidens und kann eine Multiparameteranalyse ohne Kompensations Anforderungen.
Dieses Protokoll beschreibt die spektrale Analyse der Durchflusszytometrie, so dass für eine 21-Parameter (19 Fluoreszenzsonden) Charakterisierung und die Verwaltung eines Autofluoreszenzsignals, eine hohe Auflösung in kleinere Population Detektion bereitstellt. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die spektralen Durchflusszytometrie Vorteile bei der Analyse von Zellpopulationen aus Geweben schwierig präsentiert in herkömmlicher Durchflusszytometrie, wie Herz und Darm zu charakterisieren. Spectral Durchflusszytometrie so zeigt die Multiparameteranalysekapazität von hochleistungsfähigen Zytometrie herkömmlicher Strömung ohne das Erfordernis für Ausgleichs- und ermöglicht Autofluoreszenz-Management.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten, Durchflusszytometrie (FCM) wurde Studien ein verbreitetes Analysemethode essentiell für Zell Phänotypisierung. Es wurde eine wesentliche Erhöhung der verfügbaren Fluoreszenzfarbstoffe waren, insbesondere durch den violetten Laser angeregt Fluorochrome (405 nm) (zB Brilliant Violet und neue Q-Punkt – Farbstoffe). Allerdings erhöht das Wachstum der verfügbaren Fluoreszenzfarbstoffe das Risiko von überlappenden Emissionen und erfordert arbeitsintensive Kompensations Matrizen. FCM wurde weit verbreitet Zellsuspensionen aus festem Gewebe zu analysieren, aber die Anwesenheit von auto-fluoreszierenden Zellen begrenzt die Diskriminierung von spezifisch markierten Populationen.
Die Grundprinzipien der spektralen FCM werden ausführlich in Futamura et al. 1, 2. Kurz gesagt, hier verwendet, um die spektrale FCM (die Tabelle von Materialien sehen) ist mit 405, 488, und 638 nm-Laser ausgestattet. Die spektrale FCM erfasst alle emittierten fluorescence als Spektren in einem 32-Kanal-Linear-Array PMT (32CH PMT) für 500 nm bis 800 nm und 2 unabhängigen PMTs für 420 nm bis 440 nm und 450 nm bis 469 nm bzw. die die herkömmlichen Bandpassfilter ersetzt werden. Die 488 und die 405/638-nm-Laserspots sind räumlich voneinander getrennt, während die 405 nm und 638 nm Laserspots co-linear ist. Für jeden einzelnen Partikel, die spektralen FCM Maßnahmen bis zu 66 Kanäle von Fluoreszenzdaten angeregt durch die 405 nm und 488 nm Laser. Wenn Zellen durch den 638-nm-Laser angeregt werden, misst die spektrale FCM 58 Kanäle von Fluoreszenzdaten, da eine Maske, um den 638-nm-Laser von glänzenden in die PMT zu verhindern, eingeführt wird. Spectral FCM analysiert die erfassten Vollspektrumdaten mit einem Algorithmus auf der Grundlage der gewichteten Methode der kleinsten Quadrate (WLSM), die die Trennung von überlappenden Spektren Fluoreszenz ermöglicht. Spektren abgeleitet von single-gefärbten und ungefärbten Proben werden als Basisreferenzspektren erkannt. Multi-gefärbten Proben werden eine mathematisch ausgestattetUngemischt, und das Spektrum einer Probe mit gemischten fluoreszierenden Markierungen wird in eine Sammlung ihrer konstituierenden Spektren zerlegt. Die Entmischung in der Spektraltechnologie 3 , 4 ersetzt die Kompensation, die das Signal von allen Detektoren entfernt, mit Ausnahme derjenigen, die einen gegebenen Farbstoff mißt.
In dieser Studie kombinierten und testeten wir 19 Fluorochrome in einer einzigen, 21-Parameter-Analyse, die die wichtigsten hämatopoetischen Teilmengen in der Maus Milz charakterisiert charakterisiert. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die spektrale Zytometrie das Auto-Fluoreszenz-Signal steuern kann, wodurch die Charakterisierung der intestinalen intraepithelialen Lymphozyten und des embryonalen Herzens verbessert wird. In diesen Geweben erlaubte das Auto-Fluoreszenz-Management die Zuordnung von spezifischer Fluoreszenz zu Zellen, die aus der Analyse in herkömmlichem FCM ausgeschlossen würden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herkömmliche FCM auf der Detektion von Photonen basierend emittieren nach Anregung von Fluoreszenzsonden. Die Fluoreszenzemission von einem Fluorochrom in einem Detektor erfaßt ausgelegt, das Signal von einem anderen Fluorochrom zu messen induziert physikalische Überlappung. Diese Spill-over zwischen Emissionsspektren muss durch Kompensationen korrigiert werden.
Spectral FCM und Datenverarbeitung durch die Entmischung Entfaltungsalgorithmus erlaubt die Kombination von Fluorochromen mit en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen die technischen und theoretischen Beiträge in der spektralen Zytometrie von K. Futamura, die sich kritisch auch das Manuskript überarbeitet. Wir sind auch verpflichtet C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira und P. Pereira für kritisch Sicht des Manuskripts und für endlose technische Beratung und Unterstützung. Wir danken auch P. Pereira für das Geschenk der anti Vγ7-APC und Vδ4-Biotin markierten Antikörper. Wir aknowledge das Centre d'Enseignements von Pasteur-Institut für freundliche und die Dreharbeiten Logistik unterstützen. Diese Arbeit wurde vom Pasteur-Institut, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) unterstützt; die SNF und Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia – SFRH / BD / 74218/2010 (MV); und Université Paris Diderot, die Agence Nationale de la Recherche (ANR) Projekt Twothyme, die ANR und Programm REVIVE (Investition für die Zukunft) (AC).
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
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