스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석
Summary
이 문서 분광 계측법, 형광 색소를 구별하는 발광 스펙트럼의 형상을 사용하여 유동 세포 계측법에서의 새로운 접근 방식을 설명한다. 알고리즘은 보상을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리 할 수 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 고체 기관에서 분리 된 세포의 적절한 분석을 할 수 있습니다.
Abstract
유동 세포 계측법 정의하고 림프 및 기타 조혈 세포의 표현형을 분석하기 위해 지난 40 년 동안 사용되어왔다. 처음 몇 형광 색소의 분석으로 제한, 현재 다른 형광 염료 수십있다, 최대 14-18 다른 염료는 한 번에 결합 할 수 있습니다. 그러나 다음과 같은 몇 가지 제한 사항이 여전히 분석 기능을 손상. 이 때문에 형광 프로브의 다수의 데이터 분석 인해 대형 멀티 파라미터 보정 행렬들의 필요성 점점 복잡해지고있다. 고형 장기에 의한 자동 형광 세포 현탁액 (유동 세포 계측법에 의하여) 분석이 필요하므로 또한, 검출 및 다른 조직에서 특정 세포 유형을 추적 형광 단백질을 운반하는 돌연변이 마우스 모델은, 가능하게되었다. 연속적인 파장의 넓은 범위에 따라 발광 스펙트럼의 형상을 구분하는 유세포 스펙트럼, 이러한 문제를 해결한다. 데이터는 분석 승보상 행렬을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리하는 알고리즘 i 번째. 따라서, 스펙트럼 유세포 유사한 발광 피크와 형광 색소를 판별 할 수 있어야 보상 요구없이 다중 파라미터 분석을 제공 할 수있다.
이 프로토콜은 작은 모집단 검출 높은 해상도를 제공하는 파라미터 (21) (19 형광 프로브) 특성 및 자동 형광 신호의 관리를 허용 계측법 분석 스펙트럼의 흐름을 설명한다. 여기에 제시된 결과는 스펙트럼 유동 세포 계측법 같은 심장과 소장 등 계측법 종래 흐름 특성화하기 어려운 조직으로부터 세포 집단의 분석에 이점을 제공 보여준다. 유동 세포 계측법에 따라서 보상 없이도 계측법 종래 플로우를 실행 가능하고 높은 자동 형광 관리의 다중 파라미터 분석 능력을 보여주는 스펙트럼.
Introduction
지난 수십 년에서 유동 세포 계측법 (FCM)은 세포 표현형 연구에 필수적인 널리 사용되는 분석 방법이되었다. 특히 바이올렛 레이저 (405 ㎚) (예를 들어, 브릴리언트 바이올렛 새로운 Q 점 염료)에 의해 여기 된 형광 색소 가능한 형광 염료의 실질적인 증가가 있었다. 그러나 가능한 형광 염료의 성장은 중복 배출의 위험을 증가시키고 노동 집약적 보상 행렬을 필요로한다. FCM 고형 조직에서 세포 현탁액을 분석하기 위해 널리 사용되었지만, 자동 – 형광 세포의 존재는 특히 표지 집단의 차별을 제한한다.
스펙트럼 FCM의 기본 원리는 타무라 등에 상세히보고되어있다. 1,2. 간략하게, 여기서 사용되는 스펙트럼 FCM은 (재료의 테이블 참조) 405, 488, 및 638 nm의 레이저를 구비한다. 스펙트럼 FCM 모든 출사 F 캡처800 내지 500 nm이고, 종래의 대역 통과 필터를 교체 420 nm의 각각 내지 469 nm 내지 440 450 2 개 독립의 PMT에 대한 32 채널 선형 어레이 PMT (32 채널의 PMT)의 스펙트럼과 같은 luorescence. 405 nm 내지 638 nm의 레이저 스폿은 공동 선형 동안 488 및 638분의 405 nm의 레이저 반점은 공간적으로 분리된다. 각각의 입자를 들어, 405 nm의 여기에 의해 형광의 데이터를 66 개 채널과 488 nm의 레이저까지 스펙트럼 FCM 측정. 세포가 638 nm의 레이저에 의해 여기되는 경우, 마스크가 PMT에 빛나는에서 638 nm의 레이저를 방지하기 위해 삽입되기 때문에, 상기 스펙트럼은 형광 FCM 데이터 채널 (58)을 측정한다. FCM 분광 형광 스펙트럼 중첩의 분리를 가능하게 가중 최소 제곱 법 (WLSM)에 기초한 알고리즘을 사용하여 획득 된 전체 스펙트럼 데이터를 분석한다. 단일 염색 염색 된 샘플로부터 유도 된 스펙트럼은 기본 기준 스펙트럼으로서 인식된다. 멀티 스테인드 샘플을 수학적으로 장착된다비 혼합 및 혼합 된 형광 라벨 샘플의 스펙트럼 ND는 스펙트럼 성분의 집합으로 분해된다. unmixing는 분광 기술 3, 4에서는, 특정 염료를 측정 제외한 모든 검출기로부터의 신호를 제거하는 보정을 대체한다.
본 연구에서는 결합 마우스 비장에서 발견 된 주요 조혈 부분 집합을 특징으로 한, 21 매개 변수 분석 (19) 형광 색소를 테스트했다. 또한, 우리는 스펙트럼 세포 계측법 따라서 장 내 상피 림프구 및 배아 심장의 특성을 개선, 자동 형광 신호를 관리 할 수 있음을 보여 주었다. 사실,이 조직에서 자동 형광 관리는 기존의 FCM의 분석에서 제외 될 세포에 특정 형광의 할당을 허용했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
종래 FCM은 형광 물질의 여기 광을 방출 광자의 검출에 기초한다. 다른 형광 색소로부터의 신호를 측정하기위한 검출기에서 검출 한 형광 색소의 형광 방출은 물리적 오버랩을 유발한다. 방출 스펙트럼 사이에서이 파급은 보상에 의해 수정 될 필요가있다.
unmixing의 디콘 볼 루션 알고리즘 FCM 스펙트럼 데이터 처리는 다른 스펙트럼 형상을 갖는 것을 제공하는 추가의 보정없이…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 또한 비판적으로 원고를 수정 K. 타무라의 스펙트럼 세포 계측법의 기술적, 이론적 기여를 인정합니다. 우리는 C. AIT-만수르, P.-H.에도 빚 비판적 원고를 읽기위한 끝없는 기술 자문 및 지원을위한 Commere, A. Bandeira, 그리고 P. 페레이라. 우리는 또한 안티 Vγ7-APC와 Vδ4 – 비오틴 표지 항체의 선물 P 페레이라합니다. 우리는 환영하고 촬영 물류를 지원하는 파스퇴르 연구소 센터 디부 Enseignements을 aknowledge. 이 작품은 파스퇴르 연구소, 연구소 국립 드 라 상테 등 드 라 공들인 MEDICALE (INSERM)에 의해 지원되었다; 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)과 파스퇴르 증권 거래소 루 (SS); Fundação 파라 Ciência의 개 TECNOLOGIA – SFRH / BD / 2,010분의 74,218 (MV); 및 대학 파리 디드로의 회사 직원 국립 드 라 공들인 (ANR) 프로젝트 Twothyme의 ANR 및 프로그램은 (미래를위한 투자를 REVIVE) (AC).
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
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