Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso
Summary
Questo articolo descrive spettrale citometria, un nuovo approccio per citometria di flusso che utilizza le forme di spettri di emissione per distinguere fluorocromi. Un algoritmo sostituisce compensazioni e può trattare auto-fluorescenza come parametro indipendente. Questo nuovo approccio permette la corretta analisi delle cellule isolate da organi solidi.
Abstract
Citometria a flusso è stato utilizzato negli ultimi 40 anni per definire e analizzare il fenotipo di linfoide e di altre cellule ematopoietiche. Inizialmente limitata all'analisi di alcuni fluorocromi, attualmente esistono diverse decine di coloranti fluorescenti, e fino a 14-18 diversi coloranti possono essere combinati in un momento. Tuttavia, alcune limitazioni ancora alterino le capacità analitiche. A causa della molteplicità di sonde fluorescenti, analisi dei dati è diventata sempre più complessa a causa della necessità di grandi matrici compensazione multiparametriche. Inoltre, i modelli di topo mutante che trasportano proteine fluorescenti per rilevare e tracciare specifici tipi cellulari nei diversi tessuti sono diventati disponibili, quindi è necessaria l'analisi (mediante citometria di flusso) di sospensioni cellulari auto-fluorescenza ottenute da organi solidi. Spectral citometria a flusso, che distingue le forme di spettri di emissione lungo un ampio intervallo di lunghezze d'onda continue, affronta alcuni di questi problemi. I dati vengono analizzati with un algoritmo che sostituisce matrici di compensazione e tratta autofluorescenza come parametro indipendente. Così, spettrale citometria di flusso dovrebbe essere in grado di discriminare fluorocromi con picchi di emissione simili e può fornire un'analisi multiparametrica senza esigenze di compensazione.
Questo protocollo descrive il flusso spettrale analisi di citometria, consentendo un 21-parametro di caratterizzazione (19 sonde fluorescenti) e la gestione di un segnale di auto-fluorescente, fornendo alta risoluzione nel rilevamento popolazione minore. I risultati qui presentati indicano che il flusso spettrale presenta citometria vantaggi nell'analisi delle popolazioni cellulari da tessuti difficili da caratterizzare in flusso convenzionale citometria, come il cuore e l'intestino. Spectral citofluorimetria così dimostra la capacità di analisi multi-parametrica di gestione performante flusso convenzionale citometria senza obbligo di compensazione e consente auto-fluorescenza.
Introduction
Negli ultimi decenni, Citometria a flusso (FCM) è diventato un metodo analitico ampiamente disponibile essenziale per gli studi di fenotipizzazione delle cellule. V'è stato un aumento sostanziale nei coloranti fluorescenti disponibili, in particolare fluorocromi eccitati dal laser viola (405 nm) (ad esempio, viola brillante e nuovi coloranti Q-dot). Tuttavia, la crescita di coloranti fluorescenti disponibili aumenta il rischio di emissioni sovrappongono e richiede matrici compensazione intensità di lavoro. FCM diventato ampiamente utilizzato per analizzare sospensioni di cellule da tessuto solido, ma la presenza di cellule auto-fluorescente limita la discriminazione delle popolazioni specificamente etichettati.
I principi fondamentali della spettrale FCM sono riportati in dettaglio nel Futamura et al. 1, 2. Brevemente, la FCM spettrale qui utilizzato (vedere la tabella dei materiali) è dotato di 405, 488 e 638 nm laser. La spettrale FCM cattura tutto il f emessaLuorescenza come spettro in un array lineare a 32 canali PMT (32ch PMT) per 500 nm a 800 nm e 2 PMT indipendenti per 420 nm a 440 nm e rispettivamente da 450 a 469 nm che sostituiscono i tradizionali filtri passa-banda. I punti laser 488 e 405/638 nm sono separati spatialmente, mentre i punti laser 405 nm e 638 nm sono co-lineari. Per ogni singola particella, l'FCM spettrale misura fino a 66 canali di dati di fluorescenza eccitati dai laser da 405 nm e 488 nm. Quando le cellule sono eccitate dal laser da 638 nm, l'FCM spettrale misura 58 canali di dati di fluorescenza, perché viene inserita una maschera per impedire che il laser da 638 nm brilla nel PMT. FCM Spectral analizza i dati dello spettro completo acquisito con un algoritmo basato sul metodo Ponderato dei minimi quadrati (WLSM), che consente la separazione di spettri fluorescenti sovrapposti. Spectra derivata da campioni singoli macchiati e non colorati sono riconosciuti come gli spettri di base di riferimento. I campioni multi-colorati sono dotati di matematica and miscelati, e lo spettro di un campione con etichette fluorescenti misti viene scomposto in una raccolta dei suoi spettri costituente. L'unmixing, nella tecnologia spettrale 3, 4, sostituisce la compensazione che rimuove il segnale da tutti i rivelatori tranne quella che misura un determinato colorante.
In questo studio, abbiamo combinato e testati 19 fluorocromi in una singola analisi 21-parametro che caratterizza i principali sottoinsiemi ematopoietiche presenti nella milza mouse. Inoltre, abbiamo dimostrato che la citometria spettrale può gestire segnale auto-fluorescente, migliorando così la caratterizzazione intestinale linfociti intra-epiteliali e del cuore embrionale. Infatti, in questi tessuti, gestione auto-fluorescenza consentito per l'assegnazione di fluorescenza specifica per le cellule che sarebbero esclusi dall'analisi in FCM convenzionale.
Protocol
Representative Results
Discussion
FCM convenzionale si basa sulla rilevazione di fotoni emessi dopo l'eccitazione di sonde fluorescenti. L'emissione di fluorescenza di un fluorocromo rilevato in un rivelatore progettato per misurare il segnale da un altro fluorocromo induce sovrapposizione fisica. Questo ricaduta tra spettri di emissione deve essere corretto da compensazioni.
FCM spettrale e elaborazione dati dall'algoritmo unmixing deconvoluzione consente la combinazione di fluorocromi con stretti picchi di emis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo i contributi tecnici e teorici in citometria spettrale di K. Futamura, che ha anche rivisto criticamente il manoscritto. Siamo anche in debito con C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, e P. Pereira per la lettura critica del manoscritto e per la consulenza tecnica senza fine e sostegno. Ringraziamo anche P. Pereira per il dono degli anti Vγ7-APC e Vδ4-biotina anticorpi marcati. Si ringraziano il Centre d'Enseignements da Pasteur per accogliere e sostenere la logistica di ripresa. Questo lavoro è stato sostenuto dal Pasteur Institute, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); il Fondo nazionale svizzero e Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia – SFRH / BD / 74218/2010 (MV); e Université Paris Diderot, l'Agence Nationale de la Recherche (ANR) del progetto Twothyme, l'ANR, e il Programma REVIVE (investimento per il futuro) (AC).
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
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