Detectie van zeldzame mutaties in CtDNA met behulp van de volgende generatie Sequencing
Summary
Dit manuscript beschrijft een techniek voor het opsporen van mutaties van lage frequentie in ctDNA, ER-Seq. Deze methode is onderscheiden zich door het unieke gebruik van twee-directionele foutcorrectie, een speciale achtergrond filter en efficiënte moleculaire verwerving.
Abstract
De analyse van de circulerende tumor DNA (ctDNA) met behulp van de volgende generatie sequencing (NGS) uitgegroeid tot een waardevol instrument voor de ontwikkeling van klinische oncologie. De toepassing van deze methode is echter uitdagend vanwege de lage gevoeligheid in het analyseren van de trace hoeveelheid ctDNA in het bloed. De methode kan bovendien valse positieve en negatieve resultaten genereren uit deze sequencing en de daaropvolgende analyse. Ter verbetering van de haalbaarheid en de betrouwbaarheid van ctDNA detectie in de kliniek, presenteren hier we een techniek die zeldzame mutaties voor het rangschikken, verrijken zeldzame mutatie Sequencing (ER-Seq verrijkt). ER-Seq kunt onderscheiden een enkele mutatie uit 1 x 107 wild-type nucleotiden, die het maakt een veelbelovend instrument te detecteren van genetische wijzigingen van de extreem lage frequentie en dus zeer nuttig bij het bestuderen van de ziekte heterogenicity zal zijn. Op grond van de adapter van de unieke sequencing afbinding laat deze methode een efficiënt herstel van ctDNA moleculen, terwijl bij de dezelfde tijd corrigeren voor fouten bidirectionally (betekenis en antisense). Onze selectie van 1021 kb sondes verrijkt de meting van doelregio’s die betrekking hebben op meer dan 95% van de tumor-gerelateerde stuurprogramma mutaties in 12 tumoren. Deze kosteneffectieve en universele methode kan een uniek succesvolle accumulatie van genetische gegevens. Na het efficiënt filteren achtergrond fout, kan ER-seq juist zeldzame mutaties detecteren. Met behulp van een case study, presenteren we een gedetailleerd protocol demonstreren sonde ontwerp, bouw van de bibliotheek, en target DNA vangen methodologieën, terwijl ook de data-analyse-workflow. Het proces uit te voeren deze methode meestal duurt 1-2 dagen.
Introduction
Volgende-generatie sequencing (NGS), een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van de mysteries van het genoom, bieden een grote hoeveelheid informatie die genetische veranderingen onthullen kan. De toepassing van NGS analyse in de kliniek heeft meer gemeengoed, vooral voor gepersonaliseerde geneeskunde geworden. Een van de grootste beperkingen voor NGS, is echter een hoge foutenpercentage. Hoewel dit geschikt voor studeren erfelijke mutaties wordt geacht, is de analyse van zeldzame mutaties sterk beperkt1,2, vooral wanneer een “vloeibare biopsie” analyseren DNA verkregen.
Circulerende tumor is DNA (ctDNA) DNA cel-vrij (cfDNA) in het bloed dat van tumorcellen vergoten. In de meeste gevallen is de hoeveelheid ctDNA extreem laag, waardoor de detectie- en analysemethoden zeer uitdagend. CtDNA heeft echter vele aantrekkelijke kenmerken: de isolatie is minimaal invasieve, dit kan worden gedetecteerd in de vroege stadia van tumorgroei, het ctDNA niveau weerspiegelt therapeutische efficiëntie en ctDNA bevat DNA mutaties gevonden in zowel de primaire als de metastatische laesies 3 , 4 , 5. Daarom, gezien de snelle ontwikkeling van de techniek van het NGS en analyse, de toepassingvan ctDNA detectie geworden aantrekkelijker.
Verschillende massaal parallelle sequencing benaderingen hebben gebruikt voor de detectie van de ctDNA maar geen enkele van deze benaderingen hebben al geaccepteerd voor routinegebruik in klinieken als gevolg van hun beperkingen: lage gevoeligheid, gebrek aan veelzijdigheid en een relatief hoge kosten6 ,7,8. Bijvoorbeeld, corrigeert dubbelzijdig sequencing, op basis van een unieke identificatiecode (UID), herhaaldelijk fouten in de consensus bidirectionally, sequencing van de meeste fouten te verhelpen. De haalbaarheid van deze methode is echter verloren vanwege de hoge kosten en lage gegevens gebruik9,10. Evenzo wel CAPP-Seq en haar betere iteratie, IDES-CAPP11,12, grotere bruikbaarheid detectie van de cfDNA, de nauwkeurigheid en de universaliteit van deze methoden moeten worden verbeterd.
Om te voldoen aan de huidige behoefte aan nauwkeurige ctDNA detectie- en analysemethoden, ontwikkelden we een nieuwe strategie, verrijken zeldzame mutatie Sequencing (ER-Seq). Deze aanpak combineert het volgende: unieke sequencing adapters efficiënt herstellen ctDNA moleculen, met bidirectionele foutcorrectie en de mogelijkheid om te onderscheiden van een enkele mutatie van > 1 × 107 wild-type nucleotiden; 1021 kb sondes die een verrijking van de meting van doelregio’s die betrekking hebben op meer dan 95% van de tumor-gerelateerde mutaties van 12 tumoren, met inbegrip van longkanker, darmkanker, maagkanker, borstkanker, nierkanker, pancreatic kanker, leverkanker, schildklierkanker, baarmoederhalskanker, slokdarmkanker en endometrium carcinoom (tabel 1); en basislijn database screening waardoor het efficiënt en gemakkelijk te ontdekken juist zeldzame mutaties in ctDNA.
Om te bouwen van een basislijn-database, vinden alle genmutaties door ER-Seq van een aantal soortgelijke monsters (~ 1000 aan het begin). Deze echte mutaties moeten worden geverifieerd door verscheidene andere betrouwbare detectiemethoden en analyse. Vervolgens het patroon van valse mutaties samenvatten en cluster alle valse mutaties om te bouwen van de eerste basislijn-database. Doorgaan met het toevoegen van valse mutaties gevonden uit latere sequencing experimenten naar deze database. Daarom wordt deze basislijn-database een dynamische uitgebreide database, die aanzienlijk verbetert de nauwkeurigheid van de sequencing.
Ter bevordering van de vooruitgang in de tumor diagnose en toezicht, presenteren we ER-Seq, een low-cost en haalbare methode voor de verwerving van universele gegevens. We presenteren een case study die onderging ER-Seq analyse, demonstreren de juistheid ervan voor het opsporen van zeldzame mutaties en haalbaarheid voor gebruik in de kliniek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bestaan van circulerende tumor DNA (ctDNA) werd ontdekt meer dan 30 jaar geleden, maar de toepassing van ctDNA analyses nog niet routinematig in de klinische praktijk is. Belangstelling voor de praktische toepassing van ctDNA methoden is toegenomen met de ontwikkeling van technologieën voor ctDNA-detectie- en analysemethoden. Tumor monitoring met ctDNA biedt een minimaal invasieve benadering voor de beoordeling van microscopische residuele ziekte, reageren op therapie, en de Moleculaire profielen van de tumor onder …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door Geneplus-Beijing Institute.
Materials
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
Riferimenti
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A., Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
