Detección de mutaciones raras en CtDNA usando la siguiente secuencia de generación
Summary
Este manuscrito describe una técnica para la detección de mutaciones de baja frecuencia en ctDNA, ER-SS. Este método se distingue por su uso único de corrección de errores de bidireccional, un filtro de fondo especial y eficiente adquisición molecular.
Abstract
El análisis de ADN del tumor (ctDNA) mediante secuenciación de próxima generación (NGS) en circulación se ha convertido en una valiosa herramienta para el desarrollo de la oncología clínica. Sin embargo, la aplicación de este método es difícil debido a su baja sensibilidad en el análisis de la cantidad de rastro de ctDNA en la sangre. Además, el método puede generar resultados falsos positivos y negativos de esta periodicidad y posterior análisis. Para mejorar la viabilidad y fiabilidad de la detección de ctDNA en la clínica, aquí presentamos una técnica que enriquece raras mutaciones por secuenciación, enriquecer la secuencia de mutación rara (ER-Seq). ER-Seq puede distinguir una sola mutación de 1 x 107 nucleótidos de tipo salvaje, que la hace una herramienta prometedora para detectar alteraciones genéticas de frecuencia extremadamente baja y por lo tanto será muy útil en el estudio de heterogenicidad de la enfermedad. En virtud de la ligadura del adaptador de secuencia única, este método permite una recuperación eficiente de moléculas de ctDNA, mientras que al mismo tiempo corregir para los errores de forma bidireccional (sentido y antisentido). Nuestra selección de sondas de 1021 kb enriquece la medida de las regiones de destino que cubren más de 95% de las mutaciones de controlador tumorales en 12 tumores. Este método universal y rentable permite una acumulación única acertada de la información genética. Después de filtrar eficientemente el error de fondo, ER-seq precisamente puede detectar mutaciones raras. Mediante un estudio de caso, presentamos un protocolo detallado demostrando el diseño de la sonda, la construcción de la biblioteca y metodologías de captura de ADN blanco, mientras que también incluyendo el flujo de trabajo de análisis de datos. El proceso para llevar a cabo este método por lo general tarda 1-2 días.
Introduction
Secuenciación de próxima generación (NGS), una poderosa herramienta para investigar los misterios del genoma, puede proporcionar una gran cantidad de información que puede revelar alteraciones genéticas. La aplicación de análisis NGS en la clínica se ha vuelto más común, especialmente para la medicina personalizada. Sin embargo, una de las mayores limitaciones de NGS, es una tasa alta de error. Aunque se estime conveniente para estudiar las mutaciones heredadas, el análisis de mutaciones raras es grandemente limitado1,2, especialmente cuando los análisis de ADN obtienen de una “biopsia líquida”.
Tumor de circulación (ctDNA) el ADN es ADN libre de células (cfDNA) en la sangre que se derrama de las células del tumor. En la mayoría de los casos, la cantidad de ctDNA es extremadamente baja, que hacen muy difícil su detección y análisis. Sin embargo, ctDNA tiene muchas características atractivas: su aislamiento es mínimamente invasivo, puede detectarse en las primeras etapas de crecimiento del tumor, el nivel de ctDNA refleja la eficacia terapéutica y ctDNA contiene mutaciones de ADN encontradas en lesiones primarias y metastásicas 3 , 4 , 5. por lo tanto, dado el rápido desarrollo de la técnica NGS y el análisis, la aplicación de la detección de ctDNA se ha convertido en más atractiva.
Secuenciación masiva y en paralelo diferentes enfoques se han utilizado para la detección de ctDNA pero ninguno de estos enfoques han sido aceptado para uso de rutina en clínicas debido a sus limitaciones: baja sensibilidad, falta de flexibilidad y un costo relativamente alto6 ,7,8. Por ejemplo, la secuencia duplex, basada en una etiqueta de identificador único (UID), repetidamente corrige errores en el consenso de forma bidireccional, rectificación de errores de secuencia de la mayoría. Sin embargo, la viabilidad de este método se pierde debido a su alto costo y baja datos utilización9,10. Del mismo modo, CAPP-Seq y su repetición mejora, CAPP-IDES11,12, tienen mayor practicidad en la detección de cfDNA, aunque la precisión y la universalidad de estos métodos necesitan mejora.
Para satisfacer la necesidad actual de ctDNA precisa detección y análisis, hemos desarrollado una nueva estrategia, enriquecer rara mutación secuencia (ER-Seq). Este enfoque combina las siguientes: adaptadores de secuencia única para recuperar eficientemente las moléculas de ctDNA, con corrección de errores de bidireccional y la capacidad para distinguir una sola mutación de > 1 × 107 nucleótidos de tipo salvaje; sondas de 1021 kb que enriquecen la medida de las regiones de destino que cubren más de 95% de las mutaciones relacionadas con el tumor de 12 tumores, incluyendo cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de cuello uterino, cáncer de esófago y carcinoma endometrial (tabla 1); y base de datos de línea de base lo que es eficaz y fácil para precisamente detectar mutaciones raras en ctDNA.
Para construir una base de datos de línea de base, encontrar todas las mutaciones de gene por ER-Seq de varios del mismo tipo de muestras (~ 1000 al principio). Estas mutaciones reales deben ser verificadas por otros métodos de detección confiable y análisis. A continuación, resume el patrón de mutaciones falsa y cluster todas las mutaciones falsa para construir la base de datos de línea de base inicial. Seguir añadiendo falso mutaciones encontradas en experimentos de secuenciación posterior a esta base de datos. Por lo tanto, esta base de datos de línea de base se convierte en una mayor base de datos dinámica, que mejora significativamente la precisión de la secuencia.
Para promover el progreso en el diagnóstico del tumor y seguimiento, presentamos ER-Seq, un método de bajo costo y factible para la adquisición de datos universal. Presentamos un caso de estudio que experimentó el análisis ER-Seq, demostrando su exactitud para detectar mutaciones raras y factibilidad para el uso en la clínica.
Protocol
Representative Results
Discussion
La existencia de circulación ADN del tumor (ctDNA) fue descubierta hace más de 30 años, sin embargo la aplicación del análisis ctDNA es todavía no habitual en la práctica clínica. Interés en la aplicación práctica de métodos de ctDNA ha aumentado con el desarrollo de tecnologías para la detección de ctDNA y análisis. Tumor de monitoreo con ctDNA ofrece un acercamiento como mínimo invasor para la evaluación de enfermedad residual microscópica, respuesta a la terapia y perfiles moleculares del tumor bajo …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el Instituto de Geneplus – Beijing.
Materials
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
Riferimenti
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