Rilevazione di mutazioni Rare in CtDNA mediante sequenziamento di nuova generazione
Summary
Questo manoscritto descrive una tecnica per la rilevazione di mutazioni di bassa frequenza in ctDNA, ER-segg. Questo metodo si differenzia per il suo uso unico di correzione degli errori di bi-direzionale, un fondo speciale filtro ed efficiente acquisizione molecolare.
Abstract
L’analisi del DNA del tumore (ctDNA) utilizzo di sequenziamento di nuova generazione (NGS) in circolo è diventata uno strumento prezioso per lo sviluppo di oncologia clinica. Tuttavia, l’applicazione di questo metodo è impegnativo a causa della sua bassa sensibilità nell’analizzare la quantità in tracce di ctDNA nel sangue. Inoltre, il metodo può generare risultati falsi positivi e negativi da questa analisi di sequenziamento e successiva. Per migliorare la fattibilità e l’affidabilità di rilevazione di ctDNA nella clinica, qui vi presentiamo una tecnica che arricchisce le mutazioni rare per il sequenziamento, arricchire rara mutazione sequenziamento (ER-Seq). ER-Seq può distinguere una singola mutazione fuori 1 x 107 nucleotidi di selvaggio-tipo, che lo rende uno strumento promettente per rilevare le alterazioni genetiche di frequenza estremamente bassa e quindi sarà molto utile nello studio heterogenicity di malattia. In virtù della legatura dell’adattatore unico sequenziamento, questo metodo consente un recupero efficiente di molecole ctDNA, mentre presso lo stesso tempo per correggere errori in entrambe le direzioni (senso e antisenso). La nostra selezione di sonde 1021 kb arricchisce la misurazione delle regioni di destinazione che coprono oltre 95% delle mutazioni tumore-relativo driver in 12 tumori. Questo metodo economico e universale consente un accumulo in modo univoco successo dei dati genetici. Dopo il filtraggio efficiente errori in background, ER-seq può rilevare precisamente mutazioni rare. Utilizzando un caso di studio, presentiamo un protocollo dettagliato che dimostra sonda progettazione, la costruzione della libreria e metodologie di acquisizione del DNA bersaglio, mentre includendo anche il flusso di lavoro di analisi dei dati. Il processo per effettuare questo metodo in genere dura 1-2 giorni.
Introduction
Sequenziamento di nuova generazione (NGS), un potente strumento per indagare i misteri del genoma, in grado di fornire una grande quantità di informazioni, che possono rivelare alterazioni genetiche. L’applicazione dell’analisi NGS in clinica è diventato più comune, soprattutto per la medicina personalizzata. Una delle limitazioni più grandi di NGS, tuttavia, è un alto tasso di errore. Sebbene sia ritenuto opportuno per studiare le mutazioni ereditate, l’analisi di mutazioni rare è notevolmente limitato1,2, soprattutto quando l’analisi del DNA ottenuto da una “biopsia liquida”.
Circolazione del tumore (ctDNA) il DNA è DNA libero (cfDNA) nel sangue che è sparso dalle cellule del tumore. Nella maggior parte dei casi, la quantità di ctDNA è estremamente bassa, che rendono la rilevazione e l’analisi molto impegnativo. Tuttavia, ctDNA ha molte caratteristiche interessanti: suo isolamento è minimamente invasiva, può essere individuata nelle prime fasi di crescita del tumore, il livello di ctDNA riflette l’efficienza del trattamento e ctDNA contiene mutazioni del DNA trovate in lesioni sia primari e metastatiche 3 , 4 , 5. quindi, dato il rapido sviluppo della tecnica NGS e analisi, l’applicazione di rilevazione di ctDNA è diventato più attraente.
Sequenziamento massivamente parallelo diversi approcci sono stati utilizzati per il rilevamento di ctDNA, ma nessuno di questi approcci sono stati accettati per uso sistematico in cliniche a causa delle loro limitazioni: bassa sensibilità, mancanza di versatilità e un costo relativamente elevato6 ,7,8. Ad esempio, il sequenziamento duplex, basato su un tag di identificatore univoco (UID), ripetutamente corregge gli errori nel consenso in modo bidirezionale, che rettifica la maggior parte degli errori di sequenziamento. Tuttavia, la fattibilità di questo metodo è persa a causa del suo alto costo e dati a bassa utilizzazione9,10. Allo stesso modo, CAPP-Seq e iterazione migliorata, CAPP-IDES11,12, hanno una maggiore praticità nel rilevamento di cfDNA, anche se l’accuratezza e l’universalità di questi metodi devono essere migliorati.
Per soddisfare l’esigenza attuale ctDNA accurato rilevamento e analisi, abbiamo sviluppato una nuova strategia, arricchire rara mutazione Sequencing (ER-Seq). Questo approccio combina le seguenti: schede di sequenziamento unico per recuperare in modo efficiente le molecole di ctDNA, con correzione di errore bidirezionale e la capacità di distinguere una singola mutazione su > 1 × 107 nucleotidi di selvaggio-tipo; sonde di 1021 kb che arricchiscono la misurazione delle regioni di destinazione che coprono oltre 95% delle mutazioni da 12 tumori, tra cui il cancro del polmone, cancro colorettale, cancro gastrico, cancro al seno, cancro del rene, cancro del pancreas, cancro del fegato, cancro della tiroide, tumore-relativa cancro cervicale, cancro esofageo e carcinoma dell’endometrio (tabella 1); e database di riferimento di screening rende efficienti e facili da rilevare precisamente rare mutazioni in ctDNA.
Per creare un database di riferimento, è possibile trovare tutte le mutazioni di gene di ER-Seq da un numero dello stesso tipo di campioni (~ 1000 all’inizio). Queste mutazioni reale devono essere verificate da diversi altri metodi di rilevazione affidabili e analisi. Successivamente, riassumere il pattern di mutazioni false e tutte le mutazioni false per creare il database di previsione iniziale del cluster. Continuare ad aggiungere false mutazioni trovate da esperimenti di ordinamento successivo a questo database. Questo database di riferimento diventa quindi un database dinamico espanso, che migliora notevolmente la precisione di sequenziamento.
Per promuovere il progresso nella diagnosi del tumore e di monitoraggio, presentiamo ER-Seq, un metodo di basso costo e fattibile per l’acquisizione di dati universale. Presentiamo un caso di studio che hanno subito l’analisi ER-Seq, dimostrando l’esattezza per la rilevazione di mutazioni rare e fattibilità per l’utilizzo in clinica.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’esistenza di circolazione del tumore DNA (ctDNA) è stato scoperto più di 30 anni fa, tuttavia l’applicazione di analisi di ctDNA è ancora non di routine nella pratica clinica. Interesse per l’applicazione pratica dei metodi di ctDNA sono aumentata con lo sviluppo di tecnologie per il rilevamento di ctDNA e analisi. Monitoraggio del tumore con ctDNA offre un approccio mini-invasivo per la valutazione della malattia residua microscopica, risposta alla terapia e profili molecolari del tumore sotto lo sfondo di tumore e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da Geneplus – Beijing Institute.
Materials
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
Riferimenti
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