다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지
Summary
이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.
Abstract
차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용 하 여 종양 DNA (ctDNA) 순환의 분석 임상 종양학의 개발을 위한 유용한 도구가 되고있다. 그러나,이 방법의 응용 프로그램 때문에 혈액에 있는 ctDNA의 양을 추적 분석에서 낮은 감도 도전 이다. 또한, 메서드는이 시퀀싱 및 이후 분석에서 거짓 긍정 및 부정적인 결과 생성할 수 있습니다. 타당성과 병원에서 ctDNA 검색의 신뢰성을 개선 하기 위해, 여기 선물이 시퀀싱, 풍요롭게 드문 돌연변이 시퀀싱 (ER-Seq) 드문 돌연변이 풍요롭게 하는 기술. ER-Seq 유망한 도구 매우 낮은 주파수 유전 변경 감지를 하 게 하 고 따라서 질병 heterogenicity 공부에 매우 도움이 될 것입니다 1 x 107 야생-타입 뉴클레오티드에서 단일 돌연변이 구분할 수 있습니다. 고유한 시퀀싱 어댑터의 결 찰, 덕이 메서드 동안 오류 양방향으로 (감각과 antisense)에 대 한 동일한 시간 수정에 ctDNA 분자의 효율적인 복구를 수 있습니다. 덮어 대상 영역의 측정을 풍요롭게 하는 우리의 다양 한 1021 kb 프로브 12 종양에서 종양 관련 드라이버 돌연변이의 95%. 비용 효율적이 고 보편적인 방법이 유전자 데이터의 유일 하 게 성공적인 축적 수 있습니다. 효율적으로 배경 오류 필터링, 후 응급실-seq 정확 하 게 희귀 변이 검색할 수 있습니다. 사례 연구를 사용 하 여, 상세한 프로토콜 프로브 디자인, 도서관 건설, 대상 DNA 캡처 방법론, 데이터 분석 워크플로 포함 하는 동안에 시연 선물이. 일반적으로이 메서드를 수행 하는 과정 1-2 일 소요 됩니다.
Introduction
차세대 시퀀싱 (NGS), 강력한 도구, 게놈의 신비를 조사 하는 유전 변경을 드러낼 수 있는 정보의 대량을 제공할 수 있습니다. 병원에서 NGS 분석의 응용 프로그램은 특히 맞춤된 의학에 대 한 더 일반적인 되고있다. 그러나 NGS의 가장 큰 한계 중 하나는, 높은 오류 비율입니다. 공부 상속 된 돌연변이 적합 하다, 비록 드문 돌연변이의 분석은 크게 제한1,2, 특히 “” 액체 생 검에서 얻은 DNA를 분석.
종양을 순환 DNA (ctDNA) 종양 세포에서 헛간 혈액 세포 무료 DNA (cfDNA) 이다. 대부분의 경우, ctDNA의 수량에서는 매우 낮은 하 게 하는 그것의 탐지 및 분석 매우 도전입니다. 그러나, ctDNA는 많은 매력적인 기능: 그것의 고립은 최소한 침략 적, 종양 성장의 초기 단계에서 검출 될 수 있다, 치료 효율성을 반영 하는 ctDNA 수준 및 ctDNA 기본 및 전이성 병 변에서 발견 DNA 변이 포함 3 , 4 , 5. 따라서, NGS 기술과 분석의 급속 한 발전을 감안할 때, ctDNA 검출 응용 되고있다 더 매력적.
다른 대규모 병렬 시퀀싱 방법 ctDNA 탐지를 위해 이용 되었습니다 있지만 이러한 방법 중 누구도 클리닉 그들의 제한 때문에 일상적인 사용 하기 위해 허용: 낮은 감도, 다양성의 부족 및 상대적으로 높은 비용6 ,,78. 예를 들어 이중 시퀀싱, 고유 식별자 (UID), 태그에 따라 반복적으로 대부분의 시퀀싱 오류 조정 합의 양방향으로에서 오류를 수정 합니다. 그러나,이 방법의 타당성은 그것의 높은 비용 및 낮은 데이터 활용9,10손실. 마찬가지로, CAPP-Seq 및 그것의 향상 된 반복, CAPP IDE11,12에 있는 큰 실용성 cfDNA 탐지 정확성과 이러한 방법의 개선이 필요 하지만.
정확한 ctDNA 탐지 및 분석에 대 한 현재 필요를 충족 시키기 위해 우리는 풍요롭게 드문 돌연변이 시퀀싱 (ER-Seq)는 새로운 전략을 개발 했다. 이 방법은 다음 결합: ctDNA 분자, 양방향 오류 수정와 중 단일 변이 구별 하는 기능을 효율적으로 복구 하 고유 시퀀싱 어댑터 > 1 × 107 야생-타입 뉴클레오티드; 1021 kb 프로브 커버 대상 영역의 측정의 질을 높일 12 종양, 폐암, 대 장 암, 위 암, 유방암, 신장 암, 췌장암, 간 암, 갑 상선 암 등 종양 관련 돌연변이의 95% 자 궁 경부 암, 식도 암 및 자궁내 막 암 (표 1). 그리고 초기 데이터베이스 심사 하기가 효율적이 고 정확 하 게 ctDNA에 드문 돌연변이 검출 하기 쉽다.
초기 데이터베이스를 구축, 샘플 (처음 ~ 1000)의 같은 종류의 숫자에서 응급실-Seq에 의해 모든 유전자 돌연변이 찾아. 이 진짜 돌연변이 다른 여러 신뢰할 수 있는 검출 방법 및 분석 하 여 확인 해야 합니다. 다음, 거짓 변이의 패턴을 요약 하 고 초기 기준선 데이터베이스 구축 모든 거짓 돌연변이 클러스터. 계속이 데이터베이스에 후속 시퀀싱 실험에서 발견 하는 거짓 변이 추가 합니다. 따라서,이 기준선 데이터베이스 동적 확장된 데이터베이스, 시퀀싱 정확도 크게 향상 됩니다.
진행을 촉진 하 종양 진단 및 모니터링에서 우리는 응급실-Seq, 유니버설 데이터의 수집에 대 한 저비용이 고 실현 가능한 방법 제시. 우리 병원에서 희귀 한 돌연변이 및 사용에 대 한 타당성을 탐지 하기 위한 그것의 정확도 보여주는 수술 응급실-Seq 분석, 사례 연구를 제시.
Protocol
Representative Results
Discussion
그러나 순환 종양 DNA (ctDNA)의 존재는 ctDNA 분석의 응용 프로그램은 여전히 하지 일상적인 임상 연습에 30 여 년 전, 발견 되었다. CtDNA 검출 및 분석을 위한 기술 개발의 ctDNA 방법의 실용적인 응용 프로그램에 대 한 관심 증가 했다. 미세한 잔여 질병, 치료, 그리고 종양 진화와 intratumoral이13의 배경 아래 종양 분자 프로 파일에 대 한 응답의 평가 대 한 최소한-침략 적 접근을 제?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 Geneplus-베이징 연구소에 의해 지원 됩니다.
Materials
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
Riferimenti
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