Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti
Summary
Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.
Abstract
Tümör DNA (ctDNA) yeni nesil sıralama (NGS) kullanarak dolaşan analiz klinik Onkoloji gelişimi için değerli bir araç haline gelmiştir. Ancak, bu yöntem uygulama ctDNA kan eser miktarda analiz onun düşük duyarlılık nedeniyle zordur. Ayrıca, yöntem bu sıralama ve sonraki analiz yanlış pozitif ve negatif sonuçlar oluşturabilir. Fizibilite ve ctDNA algılama klinikte güvenilirliğini artırmak için burada sıralama, nadir mutasyon sıralama (ER-Seq) zenginleştirmek için nadir mutasyonlar zenginleştiren bir tekniği mevcut. ER-Seq son derece düşük frekanslı genetik değişiklikleri algılamak için umut verici bir araçtır ve böylece hastalık heterogenicity okumak çok yararlı olacak tek bir mutasyon 1 x 107 vahşi tipi nükleotit, dışarı ayırabilirsiniz. Benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı’nın ligasyonu sayesinde bu yöntem aynı zaman hataları uzmanlığından (anlam ve Antisens) için düzeltme iken, ctDNA molekülleri, verimli bir kurtarma sağlar. 1021 kb sondalar bizim seçim kapak üzerinde hedef bölgeleri ölçümü zenginleştiren 12 tümör tümör ile ilgili sürücü mutasyonların % 95’i. Bu maliyet-etkin ve evrensel yöntem genetik veri benzersiz olarak başarılı bir birikimi sağlar. Verimli bir şekilde arka planda hata filtreleme sonra ER-seq nadir mutasyonlar tam olarak algılayabilir. Bir örnek çalışma kullanarak, sonda tasarım, Kütüphane yapı ve hedef DNA yakalama yöntemleri, veri analizi iş akışı da dahil olmak üzere süre gösteren ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut. Genellikle bu yöntem taşımak için işlem 1-2 gün sürer.
Introduction
Yeni nesil sıralama (NGS), soykırım, sırlarını araştırmak için güçlü bir araç genetik değişiklikler ortaya çıkarabilir bilgi büyük miktarda sağlayabilir. NGS analizde klinik uygulama özellikle kişiselleştirilmiş tıp daha yaygın hale gelmiştir. NGS, en büyük sınırlamaları ancak, yüksek hata oranı biridir. Eğitim devralınan mutasyonlar için uygun sayılır, özellikle DNA analiz “sıvı biyopsisi” elde edilen nadir mutasyon analizi büyük ölçüde sınırlı1,2, olsa da.
Tümör dolaşan DNA (ctDNA) boş hücre DNA (cfDNA) tümör hücreleri döken kan var. Çoğu durumda ctDNA onun algılama ve analiz zorlayıcı olun son derece düşük miktarıdır. Ancak, ctDNA çok çekici özelliklere sahiptir: onun yalıtım minimal invaziv, tümör büyüme erken dönemlerinde algılanabilir, ctDNA düzeyi terapötik etkinlik yansıtır ve ctDNA içeren birincil ve metastatik lezyonlar bulunan DNA mutasyonları 3 , 4 , 5. bu nedenle, hızlı bir gelişme NGS tekniği ve analiz göz önüne alındığında, başvuru ctDNA algılama daha cazip oldu.
Farklı kitlesel paralel sıralama yaklaşımlar ctDNA tespiti için kullanılan ama bu yaklaşımlardan hiçbiri kliniklerde sınırlamaları nedeniyle rutin kullanım için kabul edildi: düşük duyarlılık, çok yönlülük eksikliği ve nispeten yüksek maliyetli6 ,7,8. Örneğin, bir benzersiz tanımlayıcı etiketi (UID), temel çift yönlü sıralama Art arda sıralama hatalarının en takviyeli-fikir birliği uzmanlığından hataları düzeltir. Ancak, bu yöntemin fizibilite düşük veri kullanımı9,10ve yüksek maliyet nedeniyle kaybolur. Doğruluk ve evrensellik bu yöntemlerin geliştirilmesi gerekir rağmen benzer şekilde, CAPP Seq ve geliştirilmiş, yineleme, CAPP-IDE11,12, büyük pratiklik cfDNA algılama var.
Doğru ctDNA algılama ve çözümlemesi geçerli ihtiyacını karşılamak için yeni bir strateji, nadir mutasyon zenginleştirmek (ER-Seq) sıralama geliştirdi. Bu yaklaşım aşağıdaki birleştirir: Çift yönlü hata düzeltmesi ve dışarı-in tek bir mutasyon ayırt yeteneği ile ctDNA molekülleri verimli bir şekilde kurtarmak için benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı > 1 × 107 vahşi tipi nükleotit; kapak üzerinde hedef bölgeleri ölçümü zenginleştirmek 1021 kb probları %95 12 tümörler akciğer kanseri, kolorektal kanser, mide kanseri, meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, karaciğer kanseri, tiroid kanseri, dahil olmak üzere, gelen tümör ile ilgili mutasyonların Rahim ağzı kanseri, yemek borusu kanseri ve rahim Karsinomu (tablo 1); ve verimli ve nadir mutasyonlar ctDNA içinde tam olarak algılamak kolay hale temel veritabanı eleme.
Temel veritabanı oluşturmak için ER-Seq tarafından tüm gen mutasyonlarının örnekleri (~ 1000 başına) aynı türde bir dizi bulmak. Bu gerçek mutasyonlar diğer çeşitli güvenilir algılama yöntemleri ve analiz tarafından doğrulanması gerekir. Daha sonra yanlış mutasyonların desen özetlemek ve tüm yanlış mutasyonlar ilk temel veritabanı oluşturmak için küme. Yanlış mutasyonlar sonraki sıralama deneylerden buldum bu veritabanına eklemeye devam edin. Bu nedenle, bu temel veritabanı sıralama doğruluğu önemli ölçüde artıran bir Dinamik Genişletilmiş veritabanı olur.
Tümör tanısı ve takibi devam teşvik etmek, ER-Seq, evrensel veri edinimi için düşük maliyetli ve uygulanabilir bir yöntem mevcut. Biz ER-Seq analizi, uygulanan bir vaka nadir mutasyonlar ve fizibilite kullanmak için klinikte algılama doğruluğunu gösteren mevcut.
Protocol
Representative Results
Discussion
CtDNA analizleri hala değil rutin klinik uygulamada uygulamadır ancak tümör DNA (ctDNA) dolaşan varlığını daha 30 yıl önce keşfedilmiştir. İlgi ctDNA yöntemleri pratik uygulama geliştirme teknolojileri ctDNA algılama ve çözümleme ile artmıştır. Tümör ctDNA ile izleme mikroskopik rezidüel hastalığı, tedavisi ve tümör moleküler profilleri altında arka plan tümör gelişimi ve intratumoral heterojenlik13Yanıt değerlendirilmesi için minimal invaziv bir yaklaş…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Geneplus – Beijing Enstitüsü tarafından desteklenir.
Materials
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
Riferimenti
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A., Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
