Обнаружение редкой мутации в CtDNA с помощью следующего поколения последовательности
Summary
Эта рукопись описывает метод для обнаружения мутаций низкой частоты в ctDNA, ER-Seq. Этот метод отличается ее уникальной использование коррекции ошибок двунаправленный, Специальный фон фильтра и эффективной молекулярной приобретение.
Abstract
Анализ распространения опухоли ДНК (ctDNA) с помощью следующего поколения последовательности (НГС) стал ценным инструментом для развития клинической онкологии. Однако применение этого метода является сложной задачей из-за его низкой чувствительности при анализе трассировки количество ctDNA в крови. Кроме того этот метод может генерировать ложные положительные и отрицательные результаты из этой последовательности и последующего анализа. Чтобы улучшить возможности и надежность обнаружения ctDNA в клинике, здесь мы представляем технику, которая обогащает редкой мутации для виртуализации, обогатить редкой мутации последовательности (ER-Seq). ER-Seq можно отличить один мутации из 1 x 107 одичал тип нуклеотидов, что делает его перспективным инструментом для обнаружения крайне низкой частоты генетические изменения и таким образом будет весьма полезным при изучении heterogenicity болезни. Благодаря адаптеру уникальный последовательности перевязки этот метод позволяет эффективное восстановление ctDNA молекул, в то же время исправление ошибки двунаправленно (смысл и antisense). Наш выбор 1021 КБ зондов обогащает измерение целевых областей, которые охватывают более 95% мутаций связанных с опухоль водителя в 12 опухоли. Этот экономичный и универсальный метод позволяет уникально успешным накопления генетических данных. После эффективно отфильтровывать фон ошибка, ER-seq точно можно обнаружить редкой мутации. С помощью тематического исследования, мы представляем подробный протокол, демонстрируя зонд дизайн, строительство библиотеки и целевой ДНК захвата методологии, а также включая процесс анализа данных. Процесс для выполнения этого метода обычно занимает 1-2 дней.
Introduction
Следующего поколения последовательности (НГС), мощный инструмент для исследовать тайны генома, может предоставить большое количество информации, которая может выявить генетические изменения. Применение анализа NGS в клинике стало более распространенным, особенно для персонализированной медицины. Одним из величайших ограничений NGS, однако, является высокая погрешность. Хотя это считается подходит для изучения унаследованные мутации, является анализ редких мутаций значительно ограничены1,2, особенно когда анализа ДНК получены от «жидкий биопсии».
Циркулирующих опухоли ДНК (ctDNA) — свободных клеток ДНК (cfDNA) в крови, что является пролить от опухолевых клеток. В большинстве случаев количество ctDNA крайне низка, которые делают его обнаружения и анализа очень сложным. Однако, ctDNA имеет много привлекательных особенностей: его изоляция является малоинвазивной, он может быть обнаружен на ранних стадиях роста опухоли, ctDNA уровень отражает терапевтическую эффективность и ctDNA содержит мутаций ДНК, в первичных и метастатических поражений 3 , 4 , 5. Таким образом, учитывая быстрое развитие техники NGS и анализа, приложение обнаружения ctDNA стал более привлекательным.
Различные массивно параллельной последовательности подходы были использованы для обнаружения ctDNA, но ни один из этих подходов были приняты для обычного использования в клиниках из-за их ограничений: низкая чувствительность, отсутствие универсальности и относительно высокая стоимость6 ,,78. Например дуплекс последовательности, основываясь на теге уникальный идентификатор (UID), неоднократно исправляет ошибки в двунаправленно консенсус, выпрямлять большинство последовательности ошибок. Однако возможности этого метода теряется из-за ее высокой стоимости и низкого данных использования9,10. Аналогичным образом КАПП-Seq и ее улучшение итерации, КАПП-IDES11,12, имеют большей практичности в cfDNA обнаружения, хотя точность и универсальность этих методов нуждаются в улучшении.
Для удовлетворения текущих потребностей для точного ctDNA обнаружения и анализа, мы разработали новую стратегию, обогатить редкой мутации виртуализации (ER-Seq). Этот подход сочетает в себе следующее: уникальная последовательность адаптеры эффективно восстановить ctDNA молекулы, с коррекцией ошибок двунаправленный и способность различать одной мутации из > 1 × 107 одичал тип нуклеотидов; Зонды 1021 Кб, которые обогащают измерение целевых областей, которые охватывают более 95% мутаций связанных с опухоль от 12 опухолей, включая рак легких, колоректального рака, рак желудка, рак молочной железы, рак почки, поджелудочной железы, рак печени, рак щитовидной железы, Рак шейки матки, рак пищевода и рака эндометрия (Таблица 1); и основной базы данных скрининг, что делает его эффективным и легко точно обнаружить редкие мутации в ctDNA.
Для создания основной базы данных, найти все мутации гена, ER-Seq от ряда того же типа образцов (~ 1000 в начале). Эти реальные мутации должны быть проверены несколько других методов надежного обнаружения и анализа. Далее обобщить шаблон ложных мутаций и кластера все ложные мутации для создания первоначальной основной базы данных. Продолжайте добавлять накладные мутации, нашли от последующих последовательность экспериментов в этой базе данных. Таким образом этот основной базы данных становится динамической расширенной базы данных, что значительно повышает точность последовательности.
Для содействия прогрессу в опухоли диагностики и мониторинга, мы представляем ER-Seq, низкой стоимости и осуществимости метода для получения данных. Мы представляем тематическое исследование, которое прошли анализ ER-Seq, демонстрируя свою точность обнаружения редкой мутации и возможности для использования в клинике.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существование циркулирующей ДНК опухоли (ctDNA) было обнаружено более 30 лет назад, однако применение ctDNA анализов до сих пор не рутинной в клинической практике. С развитием технологий для обнаружения ctDNA и анализа возрос интерес к практическому применению методов ctDNA. Опухоль мониторинг с …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Институтом Geneplus – Пекин.
Materials
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
Riferimenti
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A., Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
