Summary
一种简便、适应性强的肉汤稀释法筛选抗真菌化合物和提取物。
Abstract
真菌感染已成为近几十年来的重要医学条件, 但现有抗真菌药物的数量有限。在这种情况下, 寻找新的抗真菌药物是必要的。此处报告的协议详细介绍了一种筛选肽的抗真菌性质的方法。它是基于从临床和实验室标准研究所 (CLSI) M27-A3 指导方针的汤稀释敏感性测试, 以适应研究抗菌肽作为潜在的新抗真菌药物。该协议描述了一种功能性的检测方法来评估抗真菌化合物的活性, 并且可以很容易地修改, 以适应任何特定的分子类别的调查。由于检测是用小体积的96井板进行的, 所以大规模的筛分可以在短时间内完成, 特别是在自动化环境下进行。这一过程说明了标准化和可调节的临床协议如何帮助新分子的板凳工作追求, 以改善真菌疾病的治疗。
Introduction
真菌感染已成为近几十年来一个重要的医疗问题, 主要是由于免疫机能丧失者的数量增加, 如接受癌症治疗的人和患有艾滋病毒/艾滋病者或移植的器官1,2。然而, 一组非常有限的可用抗真菌药物和越来越多的真菌耐药性报告导致了关于系统性部真菌病3 治疗的主要问题。
新的抗真菌化合物的潜在来源是抗菌肽 (安培), 许多生物体产生的小阳离子肽, 作为其对感染的先天免疫反应的一部分4。然而, 检测这些化合物对真菌病原体的筛选方法并不标准化。不同的程序已经被用来评估安培的抗真菌活性, 有时对于相同的模型微生物5,6,7。在某些协议中, 这些差异和细节的缺乏使化合物的比较复杂化, 并阻碍了重现性。
对新药候选者进行标准化测试的一种方法是遵循在临床环境中确定抗真菌敏感性的指导方针, 如临床和实验室标准研究所 (CLSI) M27-A3 指南。然而, 这些抗真菌敏感性测试是太限制性的, 并没有考虑到不同物种的新陈代谢变化, 因为它们只是建立了一些选择剂。例如, 它们不考虑非发酵酵母的代谢需要。
该协议允许评估潜在的抗真菌化合物的活性, 并在这里实施, 以寻找抗真菌肽。它的基础上的汤稀释敏感性测试从 CLSI M27-A3 指南与修改, 优化筛选新化合物8,9。这些变化允许使用少量的化合物, 温度或初始接种的变化, 和不同的介质, 以获得最佳的预试生长, 同时使用参照抗真菌药物作为控制来标准化结果。这种方法, 利用多井培养板, 使其能够快速和可靠地筛选出大量的化合物。
由于其固有的灵活性, 本议定书可用于不同的化学类化合物和其他微生物, 几乎没有适应。
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Protocol
1. 解决方案和媒体
- 准备2X 的罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 1640 中等, 磷酸盐缓冲盐水 (PBS), Sabouraud 葡萄糖汤和 Sabouraud 葡萄糖琼脂按表 1。
2. 真菌接种生长条件
- 将所有真菌菌株储存在35% 甘油-80 摄氏度, 直到需要。
- 在每个实验之前执行以下步骤。
- 对于白色念珠菌菌株:
- 解冻一个股票瓶和转移200µL 到10毫升 Sabouraud 葡萄糖汤在一个无菌50毫升聚丙烯管与帽和文化隔夜在30°c 与鼓动 (200 rpm)。记住要倾斜的管和离开帽稍微开放, 以更好地曝气的文化。
- 对于隐球菌菌株:
- 刮掉一瓶的冷冻表面。将细胞印在 Sabouraud 葡萄糖琼脂板上, 在30摄氏度孵育48小时。在被隔绝的殖民地的可见的成长以后, 保持板材在冰箱 (4 °c) 密封与石蜡膜至多15天。
- 用无菌牙签或无菌接种环从盘子中收集一个中型的孤立菌落, 并在无菌50毫升圆锥管中接种10毫升的 Sabouraud 葡萄糖汤。孵育大约24小时在30°c 在鼓动之下 (200 转每分钟)。
- 不要超过24小时的孵化。记住要倾斜的管和留下的帽子稍微开放, 以更好的曝气。在每次试验前, 标准化细胞的生长阶段总是好的, 因为这是影响抗菌素耐药性的一个重要因素。
注: 两种真菌生长在30摄氏度, 以快速繁殖在我们的实验, 但温度可以改变, 以反映研究的目的, 例如临床治疗 (37 °c)。最重要的是, 这最初的孵化时间应该事先建立在每个真菌分离和保持在所有的测试, 以确保重现性。
- 对于白色念珠菌菌株:
- 真菌生长后, 在室温下用 1200 x g 离心锥形管以5分钟的速度收集细胞。丢弃上清, 加入10毫升的 PBS。
- 并用重悬细胞和离心机在室温下再以 1200 x g 为5分钟。
- 重复 PBS 洗涤和离心两次以上。第三次洗涤后, 并用重悬细胞在5毫升 (根据颗粒大小) 的 2X RPMI-1640 培养基。
- 准备1毫升的1:100 或 1:1, 000 稀释在一个离心管 (取决于混浊的细胞悬浮)。
- 整除10µL 的稀释, 把它放在一个 hemocytometer 室, 并计算在显微镜下四角象限的细胞总数。用公式计算浓度: (总细胞 number/4) x 稀释因子 x 104 (室稀释常数)。
- 考虑到100% 的可行性, 如果生存能力计数和生长条件已有系统地相关的隔离被研究。
注: 可根据欧洲抗菌药敏试验委员会 (EUCAST) 对酵母的抗真菌性最低抑制浓度 (MIC) 方法, 对活性计数进行标准化和质量控制10. - 如果没有为研究中的隔离物建立生长/存活相关性, 则通过对 hemocytometer 中的活细胞进行计数来测量真菌的生存能力, 并借助染料选择性地着色死细胞, 如 phloxine B11、台盼蓝12或双面绿色13。仅当目前人口的生存能力为90% 或以上时, 才使用此协议的真菌细胞。
注: 死/活染料可能与选择的真菌没有很好的配合。请在使用前进行测试。例如, 台盼蓝染料与C. 隐球菌不太配合。
- 考虑到100% 的可行性, 如果生存能力计数和生长条件已有系统地相关的隔离被研究。
- 然后, 在 2X RPMI-1640 培养基 (2X 调整后的接种 RPMI-1640 培养基) 中制备细胞悬浮液。对于96井板, 考虑每块板的体积为5毫升。
- 对于所有的C. 白念珠菌菌株, 准备一个股票细胞悬浮 4 x 103细胞/毫升。这种浓度是每个井中最终细胞浓度的 2X (2 x 103细胞/毫升)。
- 对于C. 隐球菌菌株, 准备 2 x 104细胞/毫升细胞的股票培养。这个浓度是两次的最终细胞浓度在每个井 (1 x 104细胞/毫升)。
- 对于其他真菌, 测试与已知的抗真菌药物浓度将是理想的特定研究与孵化时间有关。考虑到真菌的新陈代谢和重复时间。
3. 多肽 (未知剂)
- 将冻干肽贮存在-20 摄氏度, 在每次试验前将其溶解于去离子水中。一旦溶解在水中的最大贮存时间将取决于每种肽的性质。
- 准备两次整除数的最高最终浓度测试 (2X)。理想情况下, 准备少量的整除数, 用足够多的肽一次使用, 以避免冻融循环。
注: 浓度的选择应以文献和肽的性质为基础。建议用大约100µM 的肽开始序列稀释, 然后根据得到的结果减少或增加这个浓度范围。
4. 参考抗真菌药物 (积极控制)
- 为那些稀释在水: 准备一个2X 解决方案最高的集中分析 (参见部分 5: 抗真菌化验为稀释的步)。
- 对于C. 白色念珠菌菌株, 准备128µg/毫升氟康唑或128µg/毫升的卡泊芬溶液。两个板块的浓度将是64µg/毫升。
- 对于C. 隐球菌菌株, 准备32µg/毫升两性霉素 B (水溶性溶液) 的溶液。板块浓度将为16µg/毫升。
注意: 通常两性霉素 B 在二甲基亚砜 (亚砜) 中被稀释, 因为这种抗真菌在水中是不溶的。然而, 有水溶性两性霉素 B 制剂在商业上可用。
- 对于在有机溶剂中稀释的抗真菌药物: 在亚砜中准备一个100X 的库存溶液, 然后将其稀释到10X 的水中使用。
注: 因此, 在井中, 亚砜的最终浓度不会超过1%。如果真菌在含有1% 亚砜的介质中生长, 就需要控制, 因为有些真菌不能很好地耐受这种浓度的溶剂。请记住, 亚砜是光敏的, 所以用箔盖住盘子, 或者把它放在一个黑暗的房间里, 在潜伏期期间。
5. 抗真菌试验
注:体外抗真菌检测是根据临床和实验室标准研究所 (CLSI) M27-A3 指南中的稀释敏感性试验进行的, 并进行了一些修改。
- 制备每种肽的双倍序列稀释剂, 并控制96井聚苯乙烯微型中的抗真菌, 最终体积为50µL。
- 使用吸管添加100µL 的抗真菌/肽的最高预期最终浓度的2X 浓度在1-3 列, 在行 a。
- 使用多通道吸管, 将50µL 的无菌水添加到其他井中, 排在 B 至 H。
- 去除50µL 的油井浓度最高 (A 排), 转移到下一个浓度 (行 B) 和融汇下井。
- 重复上述步骤, 直到井与最低浓度和丢弃50µL 的这个井 (行 H)。将列11和 12 (行 A、B、C) 保留为空白控制或负/增长控制的唯一水。
- 在 RPMI-1640 介质中, 将2X 调整后的接种添加50µL (1-3 列加11列 (负/生长控制));C. 白念珠菌的最终浓度为 2 x 103细胞/毫升, 最后浓度为C. 隐球菌菌株将为 104细胞/毫升。
- 准备空白控制 (50 µL 水 + 50 µL 2X RPMI-1640 培养基无细胞) 和负/生长控制 (50 µL 水 + 50 µL 调整接种 2X RPMI-1640 培养基没有抗真菌), 并加载到井板如上所述。
- 对每个要测试的化合物和所选择的抗真菌控制 (列 4-10) 重复该过程。
注意: 如果需要测试的给定化合物/提取物的稀释数量为八或更多, 则可以垂直于下面的实验或在板中水平 (即) 进行串行稀释。- 如果化合物、参考药物或其任何成分是光敏的, 则在还原光中进行检测, 用箔盖住盘子, 或在孵化期间放置在暗腔中。
- 请考虑以下可选建议。
- 用透明的盖板密封板, 允许气体交换, 因为这有助于减少蒸发。
- 把盘子放在潮湿的房间里;这也将有助于减少蒸发。
- 将37摄氏度的板材孵化为24小时或48小时, 用于所有c. 白念珠菌菌株, 48 h, 200 rpm 为c. 隐球菌而颤抖。较低的最终体积 (100 µL) 可确保不发生溢出。
注: C. 白念珠菌菌株的 MIC 读数在24小时和48小时之间没有显著差异。然而, 48 小时的读数更容易形象化。 - 观察所有井, 在倒置光学显微镜的协助下, 在潜伏期之前和之后验证形态学的变化以及检查是否有污染的迹象。
注意: 读数可以在实验结束时进行视觉和拍照。在每次阅读之前, 融汇略有板块。如果没有观察到细胞团簇或成丝, 也可以通过测量其 OD 在 600 nm 进行读取。 - 在不同的日期进行至少三次实验。
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Representative Results
MIC 被定义为在潜伏期结束时完全抑制可见真菌生长的最低抗菌化合物浓度。由于本议定书的目的是要有一个快速的方法来筛选潜在的抗真菌药物, 任何与透明介质类似的空白井被认为是一个积极的结果, 而任何与浊度类似的负/生长控制井是被认为是负面的。然而, 如果有兴趣知道一个给定的安培是否是抑菌作用或杀菌剂, 从积极的水井的媒体也可以镀到 Sabouraud 葡萄糖琼脂或检查其他可行性测试。
鉴于新化合物的作用机制是未知的, 因此必须验证该参考真菌是否属于真菌隔离的预期范围 (检查官方指南、表格或文献中的数据), 然后再检查测试的麦克风为化合物 (在这种情况下, 安培;图 1和图 2) 确认条件是理想的。如果它不属于受尊重的范围内, 将有必要重新运行实验, 因为它是不可能确定是否有任何变化是仅由于测试的化合物。同样重要的是, 观察所有井下的光学显微镜下和之后的潜伏期, 以检查形态学和污染的变化。
图1。用肉汤稀释法评价三肽对新生隐球菌的抗真菌活性。 真菌浓度为 1 x 104单元格/mL。测试了三多肽 (AMP1, 柱1到 3;AMP2, 专栏5到 7;AMP3, 列8到 10), 浓度范围从100µM (行 A) 到0.78 µM (行 H)。增长控制和空白分别在专栏11和12。这幅图像是在48小时的孵化后用数码相机获得的。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。用肉汤稀释法评价三肽对白色念珠菌的抗真菌活性。真菌浓度为 2 x 103细胞/毫升。测试了三多肽 (AMP1, 柱1到 3;AMP2, 专栏4到 6;AMP3, 列7到 9), 浓度范围从100µM (行 A) 到0.78 µM (行 H)。生长控制和空白被包括在化验中, 但不出现在照片中。这幅图像是在48小时的孵化后用数码相机获得的。请单击此处查看此图的较大版本.
如图 1和图 2中所示, 48 h 是足够的时间, 可以在视觉上区分正和负阱 ( c. 隐球菌和c. 白念珠菌)。值得注意的是, C. 隐球菌的结果比根据 CSLI 准则获得的早24小时, 而没有进行修改。每三个, 正面和负的井, 因此每个化合物的麦克风, 是容易辨认。这允许快速的麦克风测定多种化合物, 以及选择哪些分子值得进一步调查。同时,图 3是一个很糟糕的结果, 可能是在稀释步骤中不正确的吹打。这可以在5列 c 行中观察到, 其中C. 隐球菌增长的差异存在于复制 (列 5-7) 中。
图3。序列稀释试验中技术复制错误的示例.图像显示从100µM (a 行) 到0.78 µM (行 H) 的安培数的串联稀释。C. 隐球菌增长之间的差异存在于列5-7 中的复制之间, 在 C 行中, 很可能是由于稀释准备过程中的吹打错误。请单击此处查看此图的较大版本.
至于板块的解释, 在图 1中有一个针对C. 隐球菌的三个不同安培的抗真菌试验, 位于 AMP1 的列 1-3, AMP2 的列 5-7, 列 8-10, AMP3 的浓度变化从100µM (A 行) 到0.78 µM (行 H)。负/增长控制放在11列中, 行 a 到 c, 而空白控件放在12列中, 行 a 到 c。对于 AMP1 (列1-3、行 a C) 和 AMP2 (列5-7、行 a D), 请注意, 在较高浓度时, 介质是半透明的, 并且没有可见的增长。相比之下, 在较低浓度的井是不透明的 (列 1-3, 行 D H 和列 5-7, 行 E h)。因此, C 行被认为包含 AMP1 的麦克风, 而 AMP2 的麦克风则在 D 行中, 也就是说, 分别为25µM 和12.5 µM。AMP3 将不得不重新评估, 因为真菌生长在所有浓度测试。AMP3 的复查是确定病因的必要条件, 这可能是测试介质干扰化合物的抗真菌活性, 微生物污染, 或真菌对药剂的抗性较高。为最后的可能性, 将有必要增加测试的浓度范围。观察到, no 抑制和控制井是均匀的, 因此也可以通过 OD 测量 600 nm 来评估。
对于图 2, 对三种不同的多肽进行了对C. 白念珠菌的测试。AMP1 (列 1-3)、AMP2 (列 4-6) 和 AMP3 (列 7-9) 的麦克风分别为50µM、6µM 和25µM。C. 白色念珠菌, 由于孵化温度的成丝, 可以在无抑制和控制井丛中观察到, 使得使用 OD 测量难以进行阅读。
有时, 井中没有发现生长。这可能是由于媒介中的毒素污染 (在这种情况下, 生长控制也显示没有增长) 或对药剂的敏感性较高 (在这种情况下, 生长控制显示增长)。因此, 对于后一种情况, 可能需要减少浓度范围。
| 中期 | 制备 | |
| 2X 罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 1640 中等-500 毫升 | 10.4 克 RPMI-1640 (辅以 l-谷氨酰胺和苯酚红; 没有碳酸盐) | |
| 330毫米 3-(N-吗啉代) 丙烷磺酸 (拖把) | ||
| 调整为 pH 值 7.0naoh | ||
| 过滤消毒 (0.22 µM 过滤器) | ||
| 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) | 137毫米氯化钠 | |
| 2.7 毫米氯化钾 | ||
| 10毫米 Na2HPO4 | ||
| 2 mM2PO4 | ||
| 在121°C 蒸压釜15分钟。 | ||
| Sabouraud 葡萄糖汤 | 15克的粉末在500毫升蒸馏水。 | |
| 用氢氧化钠调节 pH 值7。0 | ||
| 在121°C 蒸压釜15分钟。 | ||
| Sabouraud 葡萄糖琼脂 | 32.5 克的粉末在500毫升蒸馏水。 | |
| 用氢氧化钠调节 pH 值7。0 | ||
| 在121°C 蒸压釜15分钟。 | ||
表1。介质和试剂的准备。
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Discussion
稀释试验可以用少量的化合物分析靶化合物的潜在抗真菌活性, 同时在浓度范围内对其进行测试。因此, 建议将本议定书作为筛选潜在新的抗真菌化合物的第一步。这里提出的协议是基于 M27-A3 协议, 最初旨在帮助选择在诊所的抗真菌疗法, 并可适应各种新的抗真菌化合物。总的来说, 该协议可以集中于提取物或化合物的物理化学特征。例如, 由于介质中的化合物可能阻止其与真菌细胞的相互作用, 如 RPMI 对 Histatin 514的影响, 检测中潜在的候选者可能会错误地显示无效。在这种情况下, 一个替代介质, 当 RPMI 干扰, 是酵母氮基 (YNB) 缓冲与拖把 pH 值 715。
该协议还允许在生长前条件、接种浓度、孵化温度和对光敏感成分的修改, 只要参考的抗真菌的结果是在指南范围之内。参考抗真菌药物应基于目前的治疗真菌物种。此外, 如果有一个与潜在药物相似的参考化合物--例如, 一种已知的抗菌肽, 抗真菌活性, 对经测试的霉菌模型-它应用作附加参考控制。
生长前的条件可以改变, 以适应真菌和研究需要。与协议, c. 隐球菌和c. 白念珠菌生长在30摄氏度, 以便更好地繁殖。然而, 这种温度可以改变取决于真菌新陈代谢: 例如, Paracoccidioides要求增长在37°c 保持它的酵母形式, 并且由于它的缓慢的复制率, 需要增长5-7 天。因此, 有必要了解真菌的特性来检测一种潜在的新药。此外, 应根据每项研究的目的确定所用细胞生长的年龄和阶段, 最重要的是, 应事先确定初始潜伏期, 并在所有测试中保持, 以确保重现性.
同样, 如果化合物/萃取物, 参考抗真菌, 或稀释剂对光敏感, 应添加步骤, 以防止其退化, 如使用减少光, 覆盖板与箔, 或放置在黑暗的房间板在孵化时间。
此外, 在空油井加水时, 边缘效应和蒸发可以减少, 不使用外水井, 用水填充, 或将盘子放在潮湿的室内。
使用这种方法的主要限制之一是它的重点是抑制活性的测试化合物, 而不是区分杀菌剂或抑菌作用效果。然而, 由于目标是快速筛选潜在的新的抗真菌药物, 最初的视觉评估麦克风与明确的积极 ("明确/非浊度" 井) 和负 ("浊度" 井) 的结果, 有助于识别感兴趣的化合物研究进一步, 因此降低了筛选新化合物的总成本。
由于这些新化合物的作用机制是未知的, 这同样的协议可以用来确定化合物的能力抑制或杀死真菌细胞通过添加一些额外的步骤, 如电镀的积极水井或使用活/死染料。其他小的修改可以添加到使用协议的棋盘滴定法, 以确定任何协同作用的化合物与其他药物。
虽然化验的读数通常是通过对不同条件下真菌生长的视觉分析来进行的, 但与没有抗真菌剂 (阴性/生长控制) 的油井生长相比, 也可以通过测量 600 nm 的 OD 来完成。然而, 虽然 OD 测量是准确的均匀的解决方案, 一些真菌生长成团, 从而打破了方法的精度-例如, 念珠菌的成丝在潜伏期的结果。
另一方面, 与 CLSI M27-A3 指南相比, 这里所描述的协议的一个主要优点是, 它考虑了媒体对非发酵真菌 (如C. 隐球菌) 的曝气。此外, CLSI 指南只使用一个小的初始接种, 因此需要延长孵化期的真菌生长和麦克风定义。一些研究表明, 更高的缩写剂和摇晃板在孵化期间改善抗真菌药敏试验, 对 MIC 测定没有显著影响16,17。我们的协议可以精确地确定新化合物对C. 隐球菌的麦克风在缩短潜伏期内, 在48小时内, 比 CLSI 指南建议的 72 h。
另一个好处是, 我们的协议使用了100µL 最终体积, 而不是200µL 推荐的 CLSI 指南, 从而减少了测试的新化合物所需的抗真菌化验的数量。然而, 外部油井的蒸发可能是一个问题, 但本节中已经描述的减少蒸发的解决方案可以在不损害化验结果的情况下使用。
此外, 通过直接执行稀释板, 从而绕过 CLSI 稀释准则使用离心管, 多通道吸管可以使用。此协议程序集比 CLSI 指南中的组件复杂得多, 而且使用的材料也较少。
与真菌细胞制剂有关的一个关键步骤是使用尽可能新鲜的细胞。同样重要的是, 在同一生长阶段对细胞进行所有的化验, 因为在文献中有好几份报告指出, 当文化年龄为18,19时, 真菌易感性的差异。仔细选择参考菌株也是必要的。一个非常敏感或很少被孤立的物种可能无法清晰地描绘出抗真菌的潜能。同样, 也有助于避免次培养步骤, 以不增加许多变量的化验。例如, 对于念珠菌菌株 (增长更快), 我们更喜欢绕过琼脂板块的步骤, 使接种直接进入液体介质。
请记住, 要测试的提取物或化合物的物理化学特征是重要的考虑。例如, 如果提取物或化合物需要溶解于水以外的溶剂中, 必须确保有一个适当的真菌生长控制, 其中包括与真菌单独相同的溶剂浓度。这是为了保证观察到的任何生长抑制不是由于溶剂而不是被测试的化合物或萃取物。在这种情况下, 最好遵循 CLSI-M27A3 推荐的亚砜稀释抗真菌药物, 如将药物溶于浓度至少比最高检测浓度高100倍, 以减少溶剂在板.
关于稳定性, 建议保持小整除数的分析提取物或化合物。通过在适当的温度下存储单个化验所需的体积, 过度操纵整除, 如果提取物或化合物被储存冷冻, 可以避免冻融循环。
最后, 最基本的步骤之一是微板块序列稀释的准确性, 因为任何吹打错误都将沿连续稀释传播。今后, 吸管的精度和适当的吹打技术是至关重要的, 以确保重现性。因此, 必须使用校准的吸管, 并始终检查是否从每个井添加和删除的数量是正确的。确保药物的残留物或痕迹不会留在吸管尖端。如果化合物倾向于贴在尖端, 最好在稀释之间切换提示。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢海角-巴西, CNPq 巴西, FAP/DF 为财政支持。我们感谢 Hugo Paes 博士修改了手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
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