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निस्र्पक प्रोटीन आधारित Hydrogels के लिए बल-क्लैंप Rheometry

Published: August 21, 2018 doi: 10.3791/58280
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physics, University of Wisconsin-Milwaukee

Summary

एक नया बल दबाना rheometry तकनीक कम मात्रा में प्रोटीन आधारित hydrogel एक आवाज का तार मोटर और एक बल संवेदक के बीच सीमित नमूनों की यांत्रिक गुणों की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक एनालॉग आनुपातिक-अभिंन व्युत्पंन (PID) प्रणाली के लिए अनुमति देता है ' clamping ' बल के वांछित प्रोटोकॉल के लिए अनुभवी ।

Abstract

यहां, हम एक बल दबाना rheometry विधि का वर्णन करने के लिए प्रोटीन आधारित hydrogels के यांत्रिक गुणों की विशेषताएं । यह विधि एक रेखीय ध्वनि-कुंडल मोटर और एक बल transducer के बीच सीमित कर रहे हैं जो बेलनाकार प्रोटीन-आधारित hydrogel नमूनों पर नियंत्रित-बल प्रोटोकॉल लागू करने के लिए एक एनालॉग आनुपातिक-अभिन्न-व्युत्पन्न (PID) सिस्टम का उपयोग करता है । ऑपरेशन के दौरान, PID प्रणाली मापा और सेट-पॉइंट बल के बीच अंतर को कम करके एक पूर्वनिर्धारित बल प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए hydrogel नमूना का एक्सटेंशन समायोजित कर देता है । प्रोटीन आधारित hydrogels के लिए यह अनूठा दृष्टिकोण बहुत कम मात्रा में hydrogel नमूनों के tethering सक्षम बनाता है (< 5 µ l) विभिन्न प्रोटीन सांद्रता के साथ. बल के तहत रैंप प्रोटोकॉल, जहां लागू तनाव बढ़ जाती है और समय के साथ रैखिक घट जाती है, प्रणाली लोच और हिस्टैरिसीस के साथ जुड़े व्यवहार के अध्ययन में सक्षम बनाता है (संयुक्त राष्ट्र) प्रोटीन की तह और मानक लोचदार की माप और viscoelastic पैरामीटर्स । के तहत लगातार बल, जहां बल पल्स एक कदम की तरह आकार है, लोचदार प्रतिक्रिया, बल में परिवर्तन के कारण, viscoelastic प्रतिक्रिया है, जो प्रोटीन डोमेन से आता है और खुलासा से जोड़ा गया है । विभिन्न यांत्रिक perturbations लागू करने में अपनी कम मात्रा के नमूने और बहुमुखी प्रतिभा के कारण, बल-क्लैंप rheometry एक थोक दृष्टिकोण का उपयोग कर बल के तहत प्रोटीन की यांत्रिक प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए अनुकूलित है.

Introduction

अद्वितीय भौतिक गुण होने के अलावा, प्रोटीन आधारित hydrogels एक ' पुल ' में कई अरब अणुओं की माप को सक्षम करने से बल स्पेक्ट्रोस्कोपी क्रांति का वादा पकड़, इस प्रकार भीड़ भरे वातावरण में प्रोटीन के अध्ययन को सक्षम करने, त्वचा और अंय ऊतकों में सामना करना पड़ा उन लोगों के लिए इसी तरह । प्रोटीन डोमेन hydrogels अंदर मुड़े हुए रहते हैं, उनके जैव यांत्रिक प्रतिक्रिया के अध्ययन के बल, बाध्यकारी भागीदारों, और रासायनिक स्थितियों की अनुमति । इसके अतिरिक्त, hydrogels अंदर प्रोटीन डोमेन के यांत्रिक प्रतिक्रिया एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक के साथ देखा प्रतिक्रिया जैसा दिखता है । उदाहरण के लिए, रासायनिक denaturants और ऑक्सीकरण एजेंटों जोड़ राज्य की स्थिरता में कमी, दोनों एकल प्रोटीन डोमेन स्तर1,2,3 पर और macroscopic स्तर4,5 पर , 6 , 7. इसी प्रकार, osmolytes एक प्रोटीन की स्थिरता में वृद्धि8,9, hydrogels की viscoelastic प्रतिक्रिया में कमी के लिए अग्रणी, एक ही बल की स्थिति के लिए7,10.

कई तरीकों या तो शारीरिक संपर्क11,12 या आबंध पार-4,13को जोड़ने का उपयोग करके, प्रोटीन संश्लेषित hydrogels आधारित करने के लिए लागू किया गया है । आबंध प्रतिक्रियाओं निश्चित पार से जोड़ने स्थानों के लिए अनुमति देते हैं और इन hydrogels यांत्रिक या रासायनिक perturbations को हटाने पर प्रारंभिक राज्य की वसूली कर सकते हैं. आबंध पार के लिए एक सफल दृष्टिकोण को जोड़ने आबंध कार्बन उजागर tyrosine अमीनो एक ऑक्सीडेंट के रूप में अमोनियम persulfate (ए. पी. एस.) का उपयोग कर एसिड के बीच कार्बन बांड बनाने पर निर्भर करता है और एक ruthenium (द्वितीय) एक सर्जक के रूप में नमक (1 चित्रा)14। सफेद प्रकाश के लिए जोखिम पर, केंद्रित प्रोटीन का एक समाधान एक hydrogel में बदल दिया जा सकता है । जब प्रतिक्रिया शुरू होता है को नियंत्रित करके, प्रोटीन-ए पी एस मिश्रण किसी भी कास्टिंग के रूप में इंजेक्ट किया जा सकता है, जैसे polytetrafluoroethylene (PFTE) ट्यूबों (आंकड़ा 1b और 1C), एक अत्यंत छोटे समाधान की मात्रा15के उपयोग की अनुमति । इसके अलावा, सफेद प्रकाश के उपयोग को ट्रिगर करने के लिए पार-फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक सीमित ब्लीचिंग में प्रतिक्रिया परिणाम जोड़ने और फ्लोरोसेंट मार्करों (चित्रा 1) के साथ समग्र hydrogels के निर्माण की अनुमति देता है । अंय प्रोटीन आधारित hydrogel गठन के तरीकों का उपयोग करें पार-SpyTag-ऑबजर्वर आबंध16संपर्क, अमीन पार glutaraldehyde13, या बायोटिन-streptavidin बातचीत के माध्यम से जोड़ने के आधार पर जोड़ने17।

गतिशील यांत्रिक विश्लेषण (DMA) वर्तमान में एक तकनीक है बड़े पैमाने पर पॉलिमर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया hydrogels आधारित13,18. जबकि DMA लगातार बल प्रोटोकॉल को लागू कर सकते है करने के लिए, यह है Young moduli पर 10 केपीए, और बड़े नमूने की मात्रा से अधिक २०० µ l19। इन सीमाओं के कारण, प्रोटीन hydrogels आम तौर पर भी इस तकनीक से जांच की जा नरम हैं । के रूप में इंजीनियर polyproteins बहुलक से संश्लेषित करने के लिए कठिन हैं, क्योंकि वे एक जीवित प्रणाली का उत्पादन करने की आवश्यकता है, इस तरह के उच्च मात्रा में अक्षम हैं, सर्वश्रेष्ठ4,15। इसके अलावा, सबसे जैविक ऊतकों 10 केपीए से नरम हैं । कई दृष्टिकोण जैविक नमूनों के लिए विकसित किए गए, विशेष रूप से मांसपेशियों की लोच के अध्ययन में20,21. इन तकनीकों को भी प्रतिक्रिया के तहत संचालित करने के लिए लगातार बल लागू कर सकते है लेकिन छोटे व्यास (माइक्रोन रेंज में) के साथ नमूनों के लिए अनुकूलित कर रहे है बहुत कम समय के लिए बल (आमतौर पर कम 1 एस से अवगत कराया) ।

प्रोटीन आधारित hydrogels सफलतापूर्वक संशोधित rheometry तकनीकों के साथ अध्ययन किया गया । उदाहरण के लिए, एक रिंग आकार में hydrogel कास्टिंग विस्तार rheometry के उपयोग के लिए एक्सटेंशन4,22के एक समारोह के रूप में अनुभवी बल में परिवर्तन को मापने के लिए अनुमति देता है । प्रोटीन आधारित hydrogels के rheological गुणों के अध्ययन के लिए अंय दृष्टिकोण नियंत्रित कतरनी-तनाव rheometry का उपयोग करें । इन तकनीकों को भी कम नमूना मात्रा को प्राप्त करने और नरम सामग्री बर्दाश्त कर सकते हैं । हालांकि, इन तरीकों की क्षमता को खींच बलों है कि vivo मेंखुलासा प्रोटीन का कारण है, और युवा मापांक जटिल सिद्धांत है कि विभिंन मांयताओं और23सुधार की आवश्यकता के आधार पर गणना की है ।

हम हाल ही में एक नया दृष्टिकोण है कि प्रोटीन की एक छोटी मात्रा का उपयोग करता है, व्यास के साथ ट्यूबों के अंदर बहुलक की रिपोर्ट < 1 mm । हमारी इस तकनीक के पहले कार्यांवयन लंबाई में काम कर रहा था, मोड दबाना, जहां जेल वांछित प्रोटोकॉल15के बाद बढ़ाया गया था । इस विधि में, प्रोटीन दोनों विस्तार और बल में एक निरंतर परिवर्तन का अनुभव जबकि डोमेन प्रकट, डेटा व्याख्या बोझिल बना । हाल ही में, हम एक नया बल दबाना rheometry तकनीक है, जहां एक प्रतिक्रिया पाश एक पूर्वनिर्धारित बल प्रोटोकॉल7 (चित्रा 2) के लिए कम मात्रा में प्रोटीन hydrogels बेनकाब कर सकते है की सूचना दी है । एक एनालॉग PID प्रणाली बल संवेदक द्वारा कंप्यूटर से भेजे गए सेट बिंदु के साथ मापा बल तुलना करता है और दो आदानों के बीच अंतर को कम करने के लिए आवाज का तार ले जाकर जेल एक्सटेंशन समायोजित कर देता है । बल के इस ' clamping ' अब प्रोटीन hydrogels के यांत्रिक को मापने के लिए प्रयोगों के नए प्रकार के लिए अनुमति देता है ।

सेना में रैंप मोड, एक सीमित प्रोटीन hydrogel एक निरंतर वृद्धि और समय के साथ बल की कमी अनुभव करता है । PID किसी भी viscoelastic विरूपण के लिए एक गैर-रेखीय तरीके में एक्सटेंशन बदलकर, प्रोटीन और hydrogel निर्माण के प्रकार के आधार पर क्षतिपूर्ति करती है । सेना रैंप का मुख्य लाभ यह है कि यह ऐसे युवा मापांक और ऊर्जा अपव्यय के रूप में मानक मापदंडों, के ठहराव की अनुमति देता है, एक खुलासा और प्रोटीन डोमेन का खुलासा करने के लिए कारण ।

निरंतर बल मोड में, लागू बल एक कदम की तरह फैशन में परिवर्तन । इस मोड में, जेल फैली हुई है और जब बल वृद्धि हुई है या कम, क्रमशः, एक समय पर निर्भर विकृति के बाद अनुबंध लोचदार । इस viscoelastic विकृति, जगह ले जा रहा है, जबकि जेल एक निरंतर शक्ति का अनुभव, सीधे डोमेन से संबंधित है खुलासा/ एक सरलीकृत तरीके से, इस विस्तार के रूप में देखा जा सकता है कई अरब एकल अणु अंश के बराबर एक साथ औसत और मापा सभी एक ही बार में । लगातार बल प्रोटोकॉल बल और समय के एक समारोह के रूप में रेंगना और प्रोटीन hydrogels की छूट का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । बल के एक समारोह के रूप में, BSA आधारित प्रोटीन hydrogels के लिए, हम हाल ही में दिखाया गया है कि वहां लोचदार और viscoelastic विस्तार के बीच एक रैखिक निर्भरता है और लागू तनाव7के साथ हटना ।

यहां हम विस्तार एक बल के आपरेशन-दबाना rheometer प्रोटीन का एक मिश्रण से बना जैल का उपयोग कर (8 डोमेन24, एल के रूप में चित्रित8) और एक प्रोटीन एल eGFP का निर्माण (एल-eGFP), जो समग्र hydrogel फ्लोरोसेंट और आसान बनाता है प्रदर्शन.

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Protocol

1. रिएजेंट समाधान तैयारी

  1. भंग द्वारा एक प्रारंभिक प्रोटीन समाधान तैयार करें/कमजोर के लिए ब्याज की प्रोटीन वांछित एकाग्रता, एक Tris बफर का उपयोग कर [20 mm Tris (hydroxymethyl) aminomethane और १५० mm NaCl, पीएच ७.४] ।
    नोट: सबसे छोटा प्रोटीन एकाग्रता के लिए जो पार से जोड़ने के लिए hydrogels की ओर जाता है प्रोटीन इस्तेमाल पर निर्भर करता है और आमतौर पर है > 1 मिमी ।
  2. अमोनियम persulfate (एपीएस) के स्टॉक्स तैयार (1 एम) और tris (bipyridine) ruthenium (II) क्लोराइड ([आरयू (bpy)3]2 +) (६.६७ mM) समाधान के अनुप को भंग करके और [Ru (bpy)3]2 + पाउडर tris बफर में ।

2. प्रोटीन आधारित Hydrogel संश्लेषण

  1. एक 1 एमएल एक दबाया गोताख़ोर के साथ सिरिंज पर एक 23 जी सुई फिक्स ।
  2. एक 10 सेमी polytetrafluoroethylene (PTFE) ट्यूब में कटौती (०.०२२ के एक भीतरी व्यास और ०.०४४ में एक बाहरी व्यास के साथ) एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग । सुई और PTFE ट्यूब के एक छोर करने के लिए सिरिंज अनुलग्न करें ।
  3. एक silane समाधान में ट्यूब के दूसरे छोर डालें और सिरिंज गोताख़ोर मुकर द्वारा ट्यूब भरें । ~ 30 मिनट के लिए ट्यूब छोड़ दें ।
  4. silane समाधान निकालें और संकुचित हवा के साथ ट्यूब सूखी ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि silane समाधान के सभी सूख गया है और कि कोई अवशेषों ट्यूब में छोड़ दिया है ।
  5. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में ए पी एस और [आरयू (bpy) 3]2 + के साथ प्रोटीन समाधान मिश्रण एक स्थिर मात्रा अनुपात का उपयोग [उदाहरणके लिए, 15:1:1 या 15:0.5:0.5 (v:v: v)] ।
  6. भंवर photoactive समाधान जब तक यह पूरी तरह से मिश्रित है ।
  7. समाधान से किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए अधिकतम गति (जैसे, १४,००० एक्स जी) में मिश्रण केंद्रापसारक ।
  8. photoactive मिश्रण में इलाज PTFE ट्यूब के खुले अंत डालें और सिरिंज गोताख़ोर को वापस लेने के द्वारा ट्यूब में समाधान आकर्षित ।
  9. एक १०० डब्ल्यू पारा लैंप से भरी हुई ट्यूब ~ 10 सेमी दूर रखें यह हीटिंग को रोकने के लिए और इसे वहां रखने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट (आंकड़ा 1b) ।
    नोट: कुछ मामलों में, प्रकाश के लिए जोखिम समय के रूप में कम किया जा सकता है के रूप में 30 एस छोटे जमाना बार यहां फ्लोरोसेंट जैल के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, photobleaching सीमा ।
  10. सुई से ट्यूब निकालें और hydrogel के पास ट्यूब के किनारों में कटौती एक उस्तरा ब्लेड के साथ समाप्त होता है ।
  11. Tris समाधान (चित्रा 1C) में hydrogel को बाहर निकालने के लिए एक 24 जी सुई कुंद का प्रयोग करें ।
    नोट: कुंद सुई hydrogel नमूना करने के लिए किसी भी पायदान या क्षति से बचने के लिए उपयोग किया जाता है.
  12. नेत्रहीन किसी भी दोष है कि बाहर निकालना या बुलबुले के कारण के दौरान फार्म का हो सकता है और दोषों के साथ जैल त्याग के लिए जैल का निरीक्षण ।

3. प्रोटीन आधारित Hydrogel लगाव और बल-क्लैंप Rheometer सेट-अप

  1. साधन नियंत्रण कार्यक्रम शुरू करते हैं । आवाज-कुंडल मोटर चालू करें । श्रेणी के अंत की ओर एक मूल्य के कुंडल स्थिति सेट (जैसे, ७.५ mm) ।
    नोट: आवाज कुंडल की स्थिति अधिकतम आंदोलन रेंज के अंत की ओर होने की सिफारिश की है, hydrogel के संभावित विस्तार को अधिकतम करने के लिए ।
  2. जगह zमें हुक-दिशा और उंहें x-दिशा में मोड़ पर संरेखित करें (जो समंवय खींच रहा है; चित्र bदेखें) । एक्स-दिशा के लिए माइक्रोमीटर शिकंजा के मूल्यों को रिकॉर्ड.
  3. बराबर लंबाई (2-3 सेमी; चित्र 3 ए और बीदेखें) की किस्में में 2 बाँझ टांके काटें ।
  4. किस्में में से प्रत्येक में एक ढीला डबल हाथ गांठ टाई और बल संवेदक से जुड़े हुक पर 2 छोरों जगह (चित्रा 3 सी और 3 डी) ।
  5. Tris बफर के साथ प्रयोगात्मक चैंबर भरें और चिकित्सा चिमटी का उपयोग कर भरे चैंबर में hydrogel नमूना हस्तांतरण ।
  6. जगह आवाज का तार और बल संवेदक समाधान सतह के पास हुक और सभी दिशाओं में हुक संरेखित करें का उपयोग कर x/y/z-स्थिति जोड़तोड़ ।
  7. मेडिकल चिमटी का उपयोग करना, आवाज का तार और बल संवेदक (चित्रा 3सी) से जुड़े हुक पर प्रोटीन hydrogel नमूना के दोनों पक्षों लटका ।
  8. चिकित्सा चिमटी के साथ सीवन पाश के दोनों सिरों को पकड़ कर और एक साथ (चित्रा 3 डी) उन्हें खींच कर आवाज का तार हुक पर hydrogel नमूना चारों ओर 1 सीवन पाश कस ।
  9. बल सेंसर (चित्रा 3d) से कनेक्ट लूप के लिए चरण ३.८ दोहराएँ ।
    नोट: hydrogel नमूना के किसी भी संरचनात्मक क्षति और आड़ा काटने को रोकने के लिए टांके की एक चरम कस से बचें ।
  10. किसी भी फिसलन को रोकने के लिए प्रत्येक हुक के झुकता पर सीवन छोरों कस; इन झुकता का उपयोग करें संदर्भ बिंदुओं के रूप में चरण ३.२ में हुक के बीच शूंय जुदाई खोजने के लिए । चिकित्सा कैंची (चित्रा 3 डी) का उपयोग कर टांके की अतिरिक्त लंबाई में कटौती ।
  11. प्रयोगात्मक समाधान में hydrogel विसर्जित करने के लिए प्रयोगात्मक चैंबर की ओर z-अक्ष के साथ z-जोड़तोड़ का उपयोग कर संलग्न hydrogel हटो.
  12. hydrogel नमूना y-z में संरेखित करता है कि जेल किसी भी तनाव के तहत नहीं है जोड़तोड़ का उपयोग कर ।
  13. शूंय बल संवेदक और दो अलग x-माइक्रोमीटर चरणों का उपयोग हुक जब तक जेल के लिए बल अनुभव शुरू होता है । एक बार ऐसा होता है, थोड़ा वापस एक्सदिशा में माइक्रोमीटर पेंच बारी है ।
  14. आवाज का तार मोटर और सेंसर के लिए दोनों जोड़तोड़ की स्थिति रिकॉर्ड और प्रयोग के शुरू में tethering हुक के बीच सटीक जुदाई की गणना करने के लिए ३.२ कदम में मापा और लोगों के बीच अंतर का उपयोग करें ।
  15. सुस्त वक्र के लिए सीमा के लिए सेट करें ~ १.५-2 मिमी और मापने जेल ढीला (आंकड़ा 4a) ।
    नोट: प्रत्येक सुस्त माप के लिए, प्रारंभिक आवाज कुंडल की स्थिति के पास सुस्त शासन की शुरुआत रखने की कोशिश, डेटा बिंदुओं की एक इष्टतम संख्या के लिए अनुमति 2 शासनों फिट करने के लिए (4a आंकड़ा). जेल लंबाई एक माइक्रोन हुक और सुस्त वक्र में 2 सरकारों के बीच चौराहे के बीच जुदाई का उपयोग कर संकल्प के साथ निर्धारित किया जा सकता है (यह भी कदम ५.१ देखें) । के रूप में बल संवेदक प्रयोगात्मक स्थितियों में बदलाव के कारण समय के साथ बहाव हो सकता है, सुस्त वक्र जहां जेल इस संभव बहाव पर बल रिपोर्ट के तहत नहीं है का हिस्सा है । साधन को नियंत्रित करने के कार्यक्रम इस अंतर के लिए स्वचालित रूप से क्षतिपूर्ति जब PID लूप करने के लिए सेट-पॉइंट आदेश भेजने (चित्रा 4a इनसेट) ।

4. प्रोटीन आधारित Hydrogel विशेषताओं का उपयोग कर नियंत्रित बल-रैंप और लगातार बल माप

  1. फोर्स-रैंप प्रयोग
    1. वांछित लोडिंग दर पर बल बढ़ाने के द्वारा एक बल रैंप चक्र प्रदर्शन करने के लिए (जैसे, ०.०१ mN/एस), इनपुट शुरू करने और अंतिम बलों और प्रोटोकॉल की अवधि के रूप में एक फ़्लिप "वी". फिर, 0 mN (या कम बल पर) के लिए जेल पकड़ > २०० एस के लिए प्रोटीन डोमेन के लिए अनुमति देने के लिए और जेल लोच को ठीक करने के लिए ।
    2. ट्रेस सहेजें ।
  2. निरंतर-बल प्रयोग
    1. कम बल लागू करके एक स्थिर-बल प्रोटोकॉल निष्पादित करें (उदा., ०.१ mn) के लिए 30 एस और फिर एक स्थिर बल (जैसे, 1 mN) समय की एक निर्धारित राशि (जैसे, १२० s), के लिए मजबूर एक ही कम करने के लिए वापस शमन द्वारा पीछा करने के लिए बल वृद्धि मान (जैसे, ०.१ mN) के लिए > ३०० एस के लिए प्रोटीन डोमेन और जेल लोच को ठीक करने की अनुमति है ।
    2. पहले पल्स के बाद, प्रतिक्रिया लूप की प्रतिक्रिया समय को अधिकतम करने के लिए PID सेटिंग्स समायोजित करें ( चित्र 2dदेखें) ।
      नोट: कड़ी जैल के लिए और बल में छोटे परिवर्तन के लिए, पाश की प्रतिक्रिया समय बल संवेदक के इलेक्ट्रॉनिक्स और कुंडल की प्रतिक्रिया समय के द्वारा सीमित है, और 5 ms7के रूप में के रूप में कम हो सकता है । नरम जैल और बल में बड़े बदलाव के लिए, प्रतिक्रिया समय hydrogels की लोच (चित्रा 2d) द्वारा तय किया जाता है ।
    3. ट्रेस सहेजें ।

5. डेटा विश्लेषण

  1. हुक और परिकलित कुंडल स्थिति के बीच मापा जुदाई का उपयोग, जब जेल बल अनुभव करने के लिए शुरू होता है ( आंकड़ा 4a डालने में Δx), जेल लंबाई की गणना समीकरण का उपयोग L :
    l = l0 + ∆ x
    यहाँ, एल0 हुक के बीच जुदाई है, प्रयोग से पहले माइक्रोमीटर शिकंजा की स्थिति से मापा (चरण ३.१४).
    नोट: कम प्रोटीन सांद्रता कि एक पूरी पार से जोड़ने में परिणाम नहीं है के साथ जैल के लिए, मापा लंबाई ट्रेस करने के लिए ट्रेस से बदल जाएगा. इसके अलावा, समय की लंबी अवधि के दौरान, hydrogels अंदर प्रोटीन उंर बढ़ने प्रभाव25है, जो जेल के एक समग्र रूप में परिणाम का अनुभव हो सकता है ।
  2. तनाव को प्राप्त करने के लिए जेल की लंबाई के लिए मापा विस्तार को सामान्य.
  3. बहुलकीकरण के लिए इस्तेमाल किया ट्यूब के भीतरी व्यास का उपयोग करके आड़ा सतह क्षेत्र के लिए मापा बल को सामान्य.

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Representative Results

चित्र 1a l-EGP/l8 hydrogel को संश्लेषित करने के लिए प्रयुक्त photoactive प्रतिक्रिया की योजना दिखाता है । चित्रा 1b से पहले और photoactivation के बाद PTFE ट्यूब में hydrogel मिश्रण से पता चलता है । चित्रा 1C प्रस्तुत एक Tris समाधान के अंदर बाहर निकाला एल eGFP-एल8 hydrogel । hydrogel नमूना कोई संरचनात्मक दोष जैसे पायदानों है । स्पष्ट रूप से दिखाई क्षति के साथ Hydrogels छोड़ दिया जाना चाहिए ।

बल दबाना rheometer के इकट्ठे और विस्फोट विचारों का प्रतिपादन चित्रा 2a और बी bमें प्रस्तुत कर रहे हैं । चित्रा 2c बल दबाना rheometer योजना है, जहां hydrogel नमूना रैखिक आवाज-कुंडल और बल संवेदक से जुड़े हुक और एक बफर समाधान में डूबे के बीच सीमित है दिखाता है । एनालॉग PID प्रणाली बल सेट बिंदु का पालन करने के लिए रेखीय-आवाज कुंडल स्थिति को नियंत्रित करके hydrogel विस्तार समायोजित कर देता है । चित्रा 2d अभिंन लाभ के लिए विभिंन वेतन वृद्धि का उपयोग कर PID की ट्यूनिंग से पता चलता है ।

चित्रा 3 एक hydrogel नमूना के एक ठेठ लगाव प्रक्रिया को दर्शाता है । गठबंधन हुक के बीच hydrogel tethering के बाद, सीवन छोरों फिसल से नमूना को रोकने के लिए और hydrogel लंबाई के सटीक निर्धारण के लिए अनुमति देने के लिए झुकता के पास hydrogel के आसपास कस रहे हैं ।

बल-रैंप माप और प्रोटीन आधारित Hydrogels का विश्लेषण:
सेना के प्रतिनिधि माप-रैंप प्रोटोकॉल चित्र 4a - 4cमें दिखाए जाते हैं. प्रत्येक नए पुल एक सुस्त माप के साथ शुरू होता है, के रूप में चित्र 4aमें दिखाया गया है । फिर, बल वक्र लोड बढ़ जाती है और समय के साथ रैखिक घट जाती है के रूप में एक औंधा "वी" प्रोटोकॉल लागू करने के द्वारा प्राप्त की है । इसके बाद, hydrogel २०० एस के लिए एक 0 mN बल पर आयोजित किया जाता है, के लिए hydrogel नमूना अंदर प्रोटीन डोमेन (चित्रा 4B) refold करने की अनुमति । तनाव के दौरान, PID प्रणाली hydrogel विस्तार की कुंडल स्थिति पूर्वनिर्धारित बल सेट बिंदु का पालन करने के द्वारा प्रतिनिधित्व संशोधित करता है । प्रत्येक सुस्त वक्र के लिए, हम 2 लाइनों (चित्रा 4c) फिट बैठते हैं । नीली रेखा का उपयोग पहले शासन को फिट करने के लिए किया जाता है जब hydrogel के पीछे हटना और नारंगी रेखा का प्रयोग किया जाता है जब hydrogel निर्बल हो जाता है । दो पंक्तियों के बीच प्रतिच्छेदन एक माइक्रोमीटर संकल्प (चित्रा 4a) के साथ सच जेल की लंबाई की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इसके बाद, hydrogel नमूना के विस्तार कुंडल स्थिति ट्रेस (चित्रा 4d) से प्रारंभिक कुंडल स्थिति घटाकर द्वारा गणना की है. चित्रा 4F तनाव की वक्र प्रस्तुत करता है । तनाव hydrogel नमूना के पार अनुभागीय क्षेत्र द्वारा लागू बल विभाजित द्वारा गणना की जाती है और तनाव विस्तार (चित्रा 4E) सच जेल लंबाई से गणना की है के रूप में आंकड़ा 4a में प्रस्तुत के रूप में निर्बल वक्र से विभाजित करके गणना की है .

लगातार बल माप और प्रोटीन आधारित Hydrogels का विश्लेषण:
एक निरंतर-बल प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि माप चित्र 5 - 5dमें दिखाए जाते हैं । ०.१ mn के एक निरंतर बल 30 एस के लिए hydrogel नमूना के लिए लागू किया जाता है, बल तो १२० एस के लिए 1 mN करने के लिए बदल दिया है, और अंत में, बल ०.१ mN करने के लिए वापस बुझती है ३०० एस के लिए प्रोटीन डोमेन refold करने के लिए अनुमति देने के लिए (5 चित्रा) । कम बल पर पहले 30 एस के दौरान, वहां जेल विस्तार में कोई उल्लेखनीय परिवर्तन है । 1 mN करने के लिए बल में वृद्धि, hydrogel एक तेजी से लोचदार विस्तार से पता चलता है. इस प्रारंभिक विस्तार के बाद, hydrogel समय के साथ विस्तार रहता है, जबकि बल लगातार (1 mN) रखते हुए । इसके बाद, बल प्रारंभिक कम मूल्य (०.१ mN) और hydrogel अपनी प्रारंभिक लंबाई (चित्रा 5B) को ठीक करने के लिए वापस बुझती है । hydrogel नमूना (चित्रा 5C) और बल के विस्तार के लिए बल रैंप मापन (चित्रा 5d) के रूप में एक समान फैशन में तनाव (ऊपर) और (नीचे) की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एल eGFP/(एल)8-आधारित hydrogel संश्लेषण । (क) इस पैनल के एक एल eGFP की योजनाबद्धता से पता चलता है/(एल)8 प्रोटीन hydrogel संश्लेषण एक photoactivated प्रतिक्रिया का उपयोग. प्रोटीन ए पी एस और [आरयू (bpy)3]2 + और सफेद प्रकाश है, जो आसंन tyrosine अमीनो एसिड (इनसेट) के बीच आबंध बांड के गठन को बढ़ावा देने के लिए उजागर के साथ मिलाया जाता है । (ख) इस पैनल के एक एल eGFP/(एल)8-, [आरयू (bpy)3]2 +-, और ए पी एस-मिश्रण एक PTFE ट्यूब सफेद प्रकाश (ऊपर) के लिए जोखिम से पहले एक 23 जी सुई का उपयोग कर में भरी हुई है, और (नीचे) के बाद । (ग) इस पैनल के एक Tris समाधान में एक-eGFP/(एल)8-आधारित hydrogel बाहर निकाले से पता चलता है । इनसेट एक एल के एक बढ़ाया छवि-eGFP/(एल)8-hydrogel आधारित दिखाता है । व्यास वितरण बहुलकीकरण (५५८ माइक्रोन) के दौरान इस्तेमाल किया PFTE ट्यूब के इंटीरियर व्यास के साथ समझौते में, ५५२ ± 8 माइक्रोन है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: बल दबाना rheometer डिजाइन और सेट अप । (क) इकट्ठे बल-दबाना hydrogel rheometer का प्रतिपादन. इनसेट में एक प्रोटीन आधारित hydrogel नमूना से पता चलता है आवाज का तार और बल संवेदक समाधान कक्ष के अंदर हुक से जुड़े । (ख) बल के विस्फोट दृश्य का प्रतिपादन-दबाना hydrogel rheometer: (a-c) आवाज को एडजस्ट करने के लिए x-y-z जोड़तोड़-कुंडल हुक स्थिति, (घ) रैखिक आवाज का तार मोटर, (ङ) बल transducer, (च) बल transducer धारक, (छ) समाधान कक्ष, और (h-i) बल transducer स्थिति को समायोजित करने के लिए x-y जोड़तोड़ । (ग) बल-क्लैंप hydrogel rheometer सेट-अप की योजना. इस योजना से पता चलता है एक प्रोटीन आधारित hydrogel नमूना एक बल संवेदक से जुड़ा हुआ है और आवाज का तार चिकित्सा टांके का उपयोग हुक । एनालॉग PID प्रणाली आवाज-कुंडल स्थिति बल सेट बिंदु का पालन करने के लिए समायोजन द्वारा hydrogel लंबाई बदल जाता है । (घ) PID प्रणाली प्रतिक्रिया अलग अभिंन-लाभ मूल्यों (I) का उपयोग बल सेट बिंदु (डैश्ड लाइन) तक पहुंचने के लिए । रंगीन अंश मापा बल (नीचे) और दबाव (ऊपर) PID प्रणाली प्रतिक्रिया से व्युत्पंन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: l-eGFP/(l)8-आधारित hydrogel अनुलग्नक प्रक्रिया । (एक) एक सीवन पाश के करीब-ऊपर देखने के लिए, हुक करने के लिए hydrogel नमूना संलग्न करने के लिए इस्तेमाल एक ढीला डबल हाथ गांठ के साथ बंधे । (ख) दो टांका छोरों बल संवेदक प्रोटीन आधारित hydrogel लगाव में इस्तेमाल किया हुक पर रखा जाता है । (ग) एक एल eGFP/(एल)8-आधारित hydrogel नमूना हुक (तीर द्वारा संकेत) के बीच लटका दिया है । (घ) आवाज का तार (बाएँ) और बल संवेदक हुक (दाएँ) के किनारे पर सीवन छोरों माप के दौरान फिसल से नमूने को रोकने के लिए प्रत्येक हुक के मोड़ पर hydrogel नमूना के आसपास कस रहे हैं. इसके बाद, अतिरिक्त टांके चिकित्सा कैंची (लाल तीर द्वारा संकेत) का उपयोग कर छंटनी कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि बल-रैंप माप और एक एल eGFP के लिए डेटा विश्लेषण घटता/(l)8-आधारित hydrogel नमूना. (एक) ठेठ सुस्त माप वक्र (लाल) बल संवेदक के शूंय बल और hydrogel की सही लंबाई निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया । दो रैखिक curves (नीले और नारंगी लाइनों) दोनों सरकारों फिट करने के लिए उपयोग किया जाता है: पहला, जब जेल बल (नीली लाइन) के तहत है, और दूसरा, जब जेल सुस्त हो जाता है (पठार-नारंगी रेखा) । दो पंक्तियों के बीच चौराहे शूंय बल पर सच hydrogel लंबाई की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । तीर गति की दिशा दिखाता है । इनसेट जीरो फोर्स और hydrogel लंबाई के सुधार का स्थान दिखाता है । (ख) प्रतिनिधि बल-रैंप वक्र hydrogel नमूना के लिए लागू किया । (ग) ट्रेस समय के एक समारोह के रूप में कुंडल स्थिति आंदोलन का प्रतिनिधित्व । कुंडल चरण ३.१ (७.५ mm) पर प्रोटोकॉल में परिभाषित प्रारंभिक स्थिति से प्रारंभ होता है । (घ) समय के एक समारोह के रूप में hydrogel नमूना के विस्तार के प्रतिनिधि वक्र । विस्तार मापा कुंडल स्थिति और उसके प्रारंभिक स्थिति के बीच विस्थापन के रूप में गणना की है । (ङ) प्रतिनिधि तनावबनामसमय वक्र । तनाव विस्तार द्वारा सही जेल की लंबाई की गणना सुस्त माप से विभाजित करके गणना की है । (च) प्रतिनिधि तनाव एक hydrogel नमूना की वक्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: निरंतर बल माप और डेटा विश्लेषण. (a) एक hydrogel के लिए लागू किया गया निरंतर-बल प्रोटोकॉल का प्रतिनिधि ट्रैस । hydrogel 30 एस के लिए ०.१ mN के संपर्क में है, फिर बल १२० s के लिए 1 mn करने के लिए वृद्धि हुई है, और अंत में, बल ३०० एस के लिए ०.१ mn करने के लिए वापस बुझती है. (ख) इस पैनल के एक कुंडल स्थिति का पता चलता है बनाम समय की लंबाई में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करने के लिए एच बल प्रोटोकॉल के बाद ydrogel नमूना । (ग) इस पैनल को जेल विस्तार से पता चलता है आवाज-कुंडल के विस्थापन से मापा । (घ) डेटा विश्लेषण के बाद तनाव (नीचे) और दबाव निशान (ऊपर) का आंकड़ा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस के साथ साथ, हम एक बल दबाना rheometry तकनीक का वर्णन करने के लिए कम मात्रा में प्रोटीन आधारित hydrogels के यांत्रिक प्रतिक्रिया की जांच । साथ ही, एक समान बेलनाकार कम मात्रा वाले प्रोटीन hydrogel नमूना को संश्लेषित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है । एक प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत किया है जो विभिंन लोच के साथ प्रोटीन आधारित hydrogels के विभिंन प्रकार के बांधने के लिए कैसे का वर्णन करता है किसी भी यांत्रिक विकृति या प्रोटीन आधारित hydrogel नमूने या हुक पर जेल के फिसल को नुकसान के कारण के बिना । एनालॉग PID प्रणाली, रैखिक आवाज का तार और बल संवेदक के साथ साथ, इस तरह के बल रैंप और लगातार बल के रूप में नियंत्रित बल प्रोटोकॉल के आवेदन को सक्षम. हाल ही में, इस तकनीक अलग प्रयोगात्मक समाधान7में BSA आधारित hydrogels के विभिन्न पार से जुड़े सांद्रता के यांत्रिक प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

एक महत्वपूर्ण पहलू जब तैयार करना और प्रोटीन hydrogels के साथ काम करना माप का reproducibility है । जैल एक बहुत कम प्रोटीन एकाग्रता या अधूरा पार से जोड़ने के साथ तैयार कर रहे हैं, तो7विस्तार के दौरान स्थायी प्लास्टिक विकृति दिखाई देगा. इन प्लास्टिक विकृति काफी डेटा व्याख्या सीमा होगी, के रूप में viscoelastic प्रभाव दोनों डोमेन खुलासा और जेल के अंदर आणविक पुनर्व्यवस्था से आना होगा । एक आसान परीक्षण देखने के लिए अगर वहां पूरा पार जोड़ने के लिए रासायनिक denaturants में hydrogel विसर्जित है, ऐसे 6 मीटर guanidinium क्लोराइड1के रूप में । इस मामले में, वहां किसी भी viscoelastic प्रभाव तनावबनाम-तनाव घटता में नहीं होना चाहिए, के रूप में सभी डोमेन रासायनिक प्रगट कर रहे हैं, और अणु अब सरल पॉलिमर4,7,26के रूप में व्यवहार कर रहे हैं । इसके अलावा, जेल अपनी प्रारंभिक लोच ठीक जब वापस प्रारंभिक बफर7में डूबे होना चाहिए ।

भिन्न जैल के साथ प्राप्त अंश के बीच मापा प्रतिक्रिया में भिन्नता हैं, तो समस्या निवारण के लिए कई पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए: समाधान में प्रोटीन एकत्रीकरण, एक गैर-सजातीय मिश्रण के साथ प्रोटीन के पार-जोड़ने रसायन, बुलबुले की उपस्थिति, प्रोटीन के बंधन आधारित hydrogel गलत silanization के कारण PFTE ट्यूब के लिए । ट्यूब दीवारों पर silane के अवशेषों hydrogel दूषित हो सकता है और संरचनात्मक दोषों के लिए सीसा । इस त्रुटि से बचने के लिए, अधिक संपीड़ित हवा ट्यूब से silane की कुल हटाने सुनिश्चित करने के लिए की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, बुलबुले PTFE ट्यूब में hydrogel photoactive मिश्रण की चूषण के दौरान फार्म कर सकते हैं । इन बुलबुले नमूना क्षति के लिए नेतृत्व और hydrogel के यांत्रिक प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं । किसी भी बुलबुला गठन को रोकने के लिए, PTFE ट्यूब के अंत में लोड हो रहा है प्रक्रिया के दौरान समाधान मिश्रण के अंदर होना चाहिए और सिरिंज गोताख़ोर धीरे मुकर जाना चाहिए. एक अंय ठेठ त्रुटि है एक से अधिक सीवन hydrogel नमूनों के आसपास के संलग्नक की प्रक्रिया के दौरान छोरों, जो एक पायदान गठन करने के लिए और hydrogel के काटने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । आवाज का तार की चलती रेंज संलग्न hydrogel नमूना के अधिकतम विस्तार को सीमित करता है । इस सीमा को ध्यान में रखा जब जैल कि उनकी प्रारंभिक लंबाई के कई सौ प्रतिशत बढ़ाने को मापने के लिए किया है । उदाहरण के लिए, २००% से अधिक के लिए एक hydrogel का विस्तार करने के लिए, एक प्रारंभिक लंबाई से कम 4 मिमी की आवश्यकता है ।

प्रोटीन आधारित hydrogels उनके लिए एक अद्वितीय वर्ग है, जो उनके साथ अपनी असंगति और उच्च खिंचाव प्रोटीन से व्युत्पंन की वजह से, उनके मुख्य निर्माण इकाइयों, और अंतर्निहित तह संक्रमण है कि प्रोटीन के लिए विशेषता है । इसके अतिरिक्त, इन hydrogels ऊतक इंजीनियरिंग, दवा वितरण प्रणाली, और 3 डी मुद्रण के लिए जैविक स्याही (bioink) के लिए एक उत्कृष्ट क्षमता है27। बल-दबाना hydrogel rheometer प्रोटीन की एक बड़ी विविधता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, बल-क्लैंप rheometer कम मात्रा hydrogel नमूनों पर लगातार बल प्रोटोकॉल के आवेदन सक्षम बनाता है । इन प्रयोगों लोचदार और viscoelastic व्यवहार और अध्ययन (संयुक्त राष्ट्र) तह यांत्रिकी के एक थोक दृष्टिकोण में युग्मन की अनुमति देते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम अनुसंधान वृद्धि पहल (पुरस्कार सं 101X340), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, प्रमुख अनुसंधान इंस्ट्रूमेंटेशन कार्यक्रम (अनुदान सं. से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । PHY-१६२६४५०), ग्रेटर मिलवॉकी फाउंडेशन (शॉ अवार्ड) और यूनिवर्सिटी ऑफ विस्कॉंसिन सिस्टम (एप्लाइड रिसर्च ग्रांट).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SI-KG4A force transducer World Precision Instruments (WPI) SI-KG4A
Linear Voice Coil Motor Equipement Solutions LFA2010
Bovine serum albumin Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) BSA-AAF-1XG / 100 G
Trizma Sigma-Aldrich T1503-1KG
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653-1KG
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 248614-100G
Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride Sigma-Aldrich 544981-1G
EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK Fisher Scientific NC0395626
1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip BD 309628
Silane, Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll Cole-Parmer EW-06417-21
Hypodermic Needle, 23 Gauge Healthcare Supply Pros 305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge KIMCO JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp ALB USH-103D USHIO
Medical Tweezers
Medical scissors
Olympus
The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author.

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References

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इंजीनियरिंग अंक १३८ बल-क्लैंप rheometry प्रोटीन आधारित hydrogels बल के तहत प्रोटीन खुलासा बल स्पेक्ट्रोस्कोपी भौतिक लोच स्मार्ट सामग्री
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