Summary
新しい力クランプ ワイヤ技術を使用して、ボイスコイル モーターと力センサーの間の連結台数の少ないタンパク質ハイドロゲル サンプルの機械的性質を調査します。アナログ比例・積分・微分 (PID) システムは、目的のプロトコルを経験の力の '固定' のことができます。
Abstract
ここでは、力クランプ ワイヤは、蛋白質ベースのゲルの力学的特性を特徴付ける方法をについて説明します。このメソッドでは、アナログの比例・積分・微分 (PID) システムを使用して、線形ボイスコイル モーターと力覚セン繋留円筒蛋白質ベースのゲルのサンプルの制御プロトコルを適用します。操作中には、PID システムは、測定とセット ポイントとの間の違いを最小限に抑えることによって、定義済みプロトコルに従うハイドロゲル サンプルの拡張機能を調整します。蛋白質ベースのゲルにこのユニークなアプローチは、異なるタンパク質濃度で非常に低いボリューム ハイドロゲル サンプル (< 5 μ L) のテザリング可能。 にします。力ランプ プロトコル、どこ、応力は増加し、時間とともに直線的に減少、下でシステムにより、タンパク質と標準的な弾性の測定 (国連) 折り畳みに関連する弾力性とヒステリシス動作の研究、粘弾性パラメーター。定数力、力パルスがステップのような形、弾性応答のため力の変化には、変性と巻き戻り蛋白質ドメインからなる粘弾性応答から分離されて。少量サンプルなど様々 な力学的摂動の適用の多様性により力クランプ ワイヤは一括アプローチを使用して力の下で蛋白質の力学的応答を調査に最適です。
Introduction
独特な物理的性質を持っていることから離れて蛋白質ベースのゲルは、従って混雑した環境で、タンパク質の研究を有効にする 1 つの '引き' でいくつかの億分子の測定を有効にすることによって力分光法を革命の約束を保持します。皮膚や他の組織に発生したものに似ています。タンパク質ドメインがパートナーとの化学的条件のバインドを強制的に、彼らの生体力学的応答の研究を許可するハイドロゲル内折れ曲がったまま。さらに、ゲル内のタンパク質ドメインの生体力学的応答分子力の分光学の技術を見られる応答に似ています。たとえば、化学変性剤と酸化剤を小さくたたんだ状態、単一のタンパク質ドメイン レベル1,2,3と巨視的レベル4、5の両方の安定性,6,7します。 同様に、浸透圧物質が単一タンパク質8,9、同じ力の条件7,10のゲルの粘弾性応答の減少につながるの安定性を高めます。
いくつかのアプローチは蛋白質ベースのゲルを合成するいずれかによって実装されている物理的相互作用11,12または共有結合性の架橋4,13を使用しています。共有結合反応固定架橋位置を可能にする、これらのゲルは、機械的又は化学的摂動の除去時に初期状態を回復できます。共有結合性の架橋に成功したアプローチは、イニシエーター (図 1)14としてルテニウム (II) 塩、酸化剤として過硫酸アンモニウム (AP) を使用して公開されるチロシンのアミノ酸間の共有結合の炭素-炭素結合を形成に依存します。白色光を浴びること、集中の蛋白質の解決はハイドロゲルに変換できます。制御することによって反応開始、タンパク質-APS ミックスはどんなキャスティング フォームに注入できますポリテトラフルオロ エチレン (PFTE) など管 (図 1 bと1 C) を使用できます非常に小規模のソリューション ボリューム15。さらに、白色光架橋反応を誘発するの使用は蛍光タンパク質の限られた漂白の結果し、蛍光マーカー (図 1) と複合ゲルの定式化をできます。その他タンパク質ハイドロゲル形成方法は、SpyTag SpyCatcher 作用16、アミン架橋経由グルタルアルデヒド13、またはビオチン ストレプトアビジン相互作用17に基づく架橋を使用します。
動的機械分析 (DMA) は現在広く高分子ヒドロゲル13,18を研究に使用される手法です。DMA は、生体に一定の力プロトコルを適用できますが、10 kPa と以上 200 μ L19の大規模なサンプル ボリューム上のヤング係数が必要です。これらの制限によりタンパク質ハイドロゲルは、一般的にこの手法によって調査されるには柔らかすぎます。設計されたコロナ リビング システムを生成が必要なため、ポリマーよりも合成するは難しいと、このような高ボリューム、ベスト4,15で効率的。さらに、ほとんどの生体組織は 10 kPa より柔らかいです。いくつかのアプローチは、筋肉の弾力性20,21の研究では特に、生体試料の開発されました。これらの技術は一定外力を適用するフィードバックの下で動作することができますもが非常に短い時間のための力にさらされている (ミクロン) の小径のサンプル用に最適化された (通常より 1 秒)。
蛋白質ベースのゲルを変更したワイヤを用いて正常に調べた。たとえば、ヒドロゲルを鋳造リング形状の拡張4,22の関数として経験を積んだ力の変化を測定する伸張のワイヤの使用をことができます。蛋白質ベースのゲルのレオロジー特性を研究するための他のアプローチは、せん断応力を制御ワイヤを使用します。これらの技術は低いサンプル ボリュームを達成し、ソフトマテリアルを容認できます。しかし、その原因タンパク質アンフォールディング生体内で、強制的にこれらのメソッドの欠如引きを模倣する能力、ヤング率は、さまざまな仮定や修正23を必要とする複雑な理論に基づいて計算されます。
中径管重合タンパク質の少量を利用した新しいアプローチを行ってきた最近 < 1 mm。この技術の私達の最初の実装目的のプロトコル15次ゲルを伸ばした長さクランプ モードで動作していた。この方法で蛋白質作りを体験拡張および力の両方の連続的な変更ドメインを展開、一方データ解釈面倒。最近では、我々 はフィード バック ループが定義済み力プロトコル7 (図 2) に少量の蛋白質ゲルを公開できる新しい力クランプ ワイヤ技術を報告しています。アナログ PID システムはコンピューターから送信セット ポイントと力センサーを用いて力を比較し、2 つの入力の差を最小限に抑えるためにボイスコイルを動かすことによってゲル拡張子を調整します。力のこの '固定' 蛋白質ゲルのバイオメカニクスを測定する実験の新しい種類今できます。
力ランプ モードで係留タンパク質ハイドロゲルは、定数の増加と時間の力の減少を経験します。PID は、タンパク質とゲル製剤の種類によって、非線形の方法で拡張子を変更する任意の粘弾性変形を補正します。力のランプの主な利点は、ヤング率と、展開とタンパク質ドメインの巻き戻しのためのエネルギー散逸などの標準的なパラメーターの定量化できます。
定数強制モードで応用力を段階的な方法で変更します。このモードでゲルは伸びると弾性力が増加または減少し、それぞれになると契約、時間依存型変形が続きます。ゲル経験一定力時に行われ、この粘弾性変形はドメインの展開/折りたたみを直結します。簡略化された方法でこの拡張機能は、十億の単一分子トレース一緒に平均化され、すべてを一度に測定はいくつかの等価なものとして見なすことができます。クリープと力と時間の関数として蛋白質ゲルの緩和を検討する定数力プロトコルを使用できます。BSA を用いたタンパク質ゲルのための力の関数として弾性および粘弾性の拡張と適用ひずみ7の反動の線形依存関係があることを最近示しました。
ここでは、全体的なハイドロゲルを蛍光簡単に L 蛋白質の混合物 (8 ドメイン24L8として描かれている) とタンパク質 L eGFP コンストラクト (L eGFP) から作られた複合ゲルを使用して力クランプ レオメータの操作を詳細します。示してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 試薬液の調製法
- [トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタンを 20 mM と 150 mM の NaCl、pH 7.4] Tris バッファーを使用して、目的の濃度に興味の蛋白質を溶解/希釈開始タンパク質溶液を準備します。
注: ヒドロゲルに架橋つながる最小のタンパク質濃度使用されるタンパク質に依存しては通常 > 1 mM。 - 過硫酸アンモニウム (AP) (1 M) の株式と tris(bipyridine)ruthenium(II) 塩化準備 ([Ru(bpy)3]2 +) APS を溶解することにより (6.67 mM) ソリューション及び Tris バッファー [Ru(bpy)3]2 +粉末。
2. タンパク質ベース ハイドロゲル合成
- 1 mL 注射器に押されたプランジャーで 23 G 針を固定します。
- かみそりの刃を使用して (で 0.022 の内径と外径の 0.044) 10 cm ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) チューブをカットします。PTFE チューブの一方の端に、針と注射器を接続します。
- しらん溶液にチューブの 2 番目の端を挿入し、シリンジのプランジャーを取り消しによって管を入力します。30 分程度の管を残します。
- シランのソリューションを削除し、圧縮空気管を乾燥します。
注: シラン ソリューションのすべてが乾燥していることと、管内残留物は残っていないことを確認します。 - APS と [Ru (bpy) 3] タンパク質溶液を混ぜる2 +定体積比を用いた 1.5 mL チューブに [例えば15:1:1 または 15:0.5:0.5 (v: v: v)]。
- 渦光ソリューション完全に混ぜ合わせます。
- (例えば、14,000 x g) 任意の気泡をソリューションから削除する最大速度でミックスを遠心します。
- 光の混合物に処理 PTFE チューブの開放端を挿入し、シリンジのプランジャーを入れ込んでチューブにソリューションを描画します。
- ロード チューブ加熱することを防ぎ、室温 (図 1 b) で最大 30 分のそこにそれを維持する 100 W 水銀ランプから 〜 10 cm を配置します。
注: 場合によっては、光を露光時間が退色を抑える、蛍光ゲルのゲル化時間の短縮を聡に 30 がここで使用される低ですることができます。 - 針からチューブを外し、かみそりの刃を持つハイドロゲル端に近くの管の端をカットします。
- 鈍化 24 G 針を使用してトリスのソリューション (図 1) に、ハイドロゲルを押し出します。
注: 鈍い針、ハイドロゲルのサンプルに損害任意のノッチを避けるために使用されます。 - 押し出し中または気泡によるを形成し欠陥をもつゲルを破棄可能性があります欠陥のゲルを目視で確認します。
3. タンパク質ベース ハイドロゲル添付ファイルとクランプ力レオメータ セットアップ
- 計測器制御プログラムを開始します。ボイスコイル モーターをオンにします。コイル位置を (例えば、7.5 mm) の範囲の終わりの方の値に設定します。
注: 最大移動範囲、ヒドロゲルへの可能な拡張を最大限の終わりの方には、ボイスコイルの位置の使用をお勧めします。 - Zのフックを転置-方向、 xでベンドでそれらを揃える-の方向 (引き座標;図 2 bを参照してください)。X用マイクロ メーターねじの値を記録-方向。
- 等しい長さの鎖に 2 滅菌縫合糸を切る (2-3 cm である;図 3 aとBを参照してください)。
- 各鎖に緩いダブルオーバーハンド ノットを結ぶ、力センサー (図 3および3 D) に接続されているフックに 2 ループ。
- Tris バッファーで実験室を埋めるし、医療ピンセットを使用して塗りつぶされた室にゲルのサンプルを転送します。
- ボイスコイルを配置、溶液表面に近いセンサー フックを力およびxを使用してすべての方向にフックを配置/y/z-マニピュレーターを配置します。
- 医療ピンセット、ハング声に接続されているフックに蛋白質ゲルのサンプルの両側コイルし、強制的にセンサー (図 3) を使用します。
- 医療ピンセットで縫合糸ループの両端を持ち、同時にそれらを引いて 1 縫合音声コイル フック ハイドロゲル サンプル ループを締めます (図 3 D)。
- ループの繰り返し手順 3.8 は力センサー (図 3 D) に接続します。
注: は、構造上の損傷およびハイドロゲル サンプルの横の切断を防ぐために縫合糸の極端な締め付けを避けてください。 - 任意のすべりを防ぐために各フックのベンドに縫合糸のループを締め3.2 でフックのゼロの区別を見つけるに参照としてこれらのベンド ポイント使用。医療はさみ (図 3 D) を使用して縫合の余分な長さをカットします。
- Zを使用してアタッチされたハイドロゲルを移動- zに沿ってマニピュレーター-実験的ソリューションでゲルを浸す実験室に向かって軸。
- Y-zマニピュレーターを使用してゲルがない任意の応力下におけるゲル サンプルを合わせます。
- 力センサーをゼロし、 xを使用して 2 つのフックを独立した-マイクロメータ ゲルを開始力を経験するまでの段階します。Xマイクロ メートルねじ少し引き返すいったんこれが起こる、-方向。
- ボイスコイル モーターとセンサーの両方のマニピュレーターの位置を記録し、これらの値と 3.2 の手順で測定したものの違いを使用して正確な実験の開始時にテザリング フック間隔を計算します。
- ~1.5 - 2 mm に余裕の曲線の範囲を設定し、ゲルの余裕期間 (図 4 a) を測定します。
注: スラック測定ごとに 2 体制 (図 4 a) に合わせて最適なデータ ポイント数、初期ボイス コイル位置近く余裕の政体の開始を維持してください。ゲルの長さはフックとたるみで 2 政体の間の交差点の間の分離を使用してミクロンの解像度で判断できます (また見なさいステップ 5.1) のカーブします。力センサー実験条件の変化のための時間のズレと下にないゲル余裕の曲線の一部はこの可能なドリフトのレポートを強制します。PID ループ (図 4 a差込み) にセット ポイント コマンドを送信するとき、計測器を制御するプログラムはこの違いを自動的に補正します。
4. 蛋白質ベース ハイドロゲル特性定数力測定と制御力ランプを使用して
-
力ランプ実験
- 力ランプ サイクルを実行すると、必要な読み込み速度 (例えば、0.01 mN/秒) に力を高めることによって、反転"V"として開始し、最終的な勢力とプロトコルの期間を入力します。その後、フォールディングとゲルの弾力性を回復するタンパク質のドメインを許可する > 200 s mN (または低力) 0 でゲルを保持します。
- トレースを保存します。
-
定数力実験
- 一定の力 (例えば、 1 マンガン) に時間の定義された量の 30 s と増加し、力の低い力 (例えば、0.1 mN) を適用することで定数力プロトコルを実行 (例えば120 s)、続いて同じに戻る力を低焼入> 300 s フォールディングとゲルの弾力性を回復するタンパク質のドメインを許可するため (例えば、0.1 mN) の値。
- フィードバックの応答時間を最大化する PID 設定を調整する最初のパルスに続くループ ( 2 D 図を参照してください)。
注: 硬いゲルおよび力の小さな変化、ループの応答時間は力センサーの電子とコイルの応答時間によって制限されます、5 ms7低くすることができます。柔らかいゲルおよび力の大きな変化は、応答時間、(図 2 D) ゲルの弾力性によって決まります。 - トレースを保存します。
5. データの解析
- ゲルの起動時に発生する力 (Δx 4 a を図の挿入)、ゲルの長さLの方程式を使って計算する、計算されるコイル位置とフックの間測定の分離を利用しました。
L = L0 + ∆x
ここでは、 L0は実験 (ステップ 3.14) の前にマイクロメータねじの位置から測定、フック間の距離です。
注: 完全な架橋が発生しない低蛋白濃度のゲル、測定長さはトレースするから変更されます。また、時間の長い期間にわたってハイドロゲル中のタンパク質があります老化効果25ゲルの全体的な延長の結果になります。 - ひずみを取得するゲルの長さ測定の延長を正規化します。
- 重合用チューブの内径を用いたトランスバーサル表面積測定力を正常化します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図 1 aは、EGP/L8ハイドロゲルを合成するために使用光反応のスキームを示しています。図 1 bは、光の前後に PTFE チューブのヒドロゲル混合物を示しています。トリス ソリューション内の押出 L eGFP8ハイドロゲルを図 1に示します。ハイドロゲルのサンプルには、ノッチなど構造上の欠陥はありません。明らかに目に見える損傷のヒドロゲルを破棄しなければなりません。
組み立てのレンダリングとクランプ力レオメータの分解図は、図 2 aと2 bに掲載されています。図 2は、線形のボイスコイルと力センサーに接続され、緩衝液中に浸漬のフックの間ハイドロゲル サンプルの係留場所力クランプ レオメータ方式を示しています。アナログ PID システムは、力セット ポイントに従う線形ボイスコイル位置を制御することによりハイドロゲル拡張子を調整します。図 2 Dは、積分ゲインのさまざまな単位を使用して、PID のチューニングを示しています。
図 3は、ハイドロゲル サンプルの一般的な添付ファイルの処理を示しています。一直線に並べられたフック間ハイドロゲルをテザリング後サンプルの滑りを防ぐために、ゲルの長さの正確な測定を許可する曲がり近くハイドロゲル周囲縫合糸ループに張られました。
力ランプの測定と解析蛋白質ベースのゲル:
力ランプ プロトコルの代表的な測定は、図 4 a - 4 Cで表示されます。図 4 aに示すように、各新しいプルたるみ計測から始まります。その後、力曲線は、負荷は増加し、時間とともに直線的に減少逆"V"プロトコルを適用して得られます。ヒドロゲルは 200 0 ミネソタ力開催その後、s フォールディングを (図 4 b) ゲルのサンプル内のタンパク質ドメインを許可します。ストレスの中には、PID システムは定義済み力のセット ポイントにコイルの位置によって表されるハイドロゲル拡張子を変更します。余裕の曲線の我々 に合う 2 行 (図 4)。最初の政権に合わせて青い線を使用、ハイドロゲルが余裕になったら政権に合わせてでハイドロゲル 2.4兆、オレンジ色のラインを使用する場合。2 本の線の交差部分を使用して、マイクロメータ解像度 (図 4 a) で真のゲルの長さを計算します。その後、ハイドロゲル サンプルの拡張子はコイル位置跡 (図 4) から初期コイル位置を差し引いて計算されます。図 4 階では、応力-ひずみ曲線を示します。ハイドロゲル サンプルの断面積によって応用力を除して計算してストレスやひずみは、図 4 a に示されるように、余裕の曲線から計算真のゲルの長さによって (図 4E) 拡張子を除して算出しました。.
定数力蛋白質ベースのヒドロゲルの計測と解析。
定数力プロトコルの代表的な測定は, 図 5 a - 5 D。0.1 mn 一定の力が 30 のハイドロゲル サンプルに適用される s、力 120 1 mN に変更されます s、そして最後に、力は 300 0.1 mN に戻る焼入れ s フォールディングを (図 5 a) タンパク質ドメインを許可します。最初の 30 の中に s 低力のゲルの拡張の顕著な変化はありません。1 mN に力を増加、ヒドロゲルは高速弾性拡張子を示しています。以下のこの最初の拡張、ハイドロゲルを保持力定数 (1 mN) を維持しながら、時間をかけて拡張します。その後、初期の低値 (0.1 mN) に戻って力を急冷、ヒドロゲルをその初期の長さ (図 5 b) に回復します。ハイドロゲルのサンプル (図 5) と力の拡張はひずみ (上) とストレス (下) 力ランプ測定 (図 5) のように同様の方法で計算する使用されます。
図 1: L-eGFP/(L)8-基づくカルシウムハイドロゲル。(A) このパネルはセンサー反応を利用した L-eGFP/(L)8タンパク質ハイドロゲル合成の概略図を示しています。タンパク質は APS と混合される [Ru(bpy)3]2 +と白色光にさらされて、隣接するチロシンのアミノ酸 (インセット) 間に共有結合の形成を促進します。(B) 、L-eGFP/(L)8・ [Ru(bpy)3]2 +-、このパネルが表示されます、APS 混合物は白色光 (上) と (下) 後の暴露の前に 23 G 針を用いて PTFE チューブに読み込まれます。(C)このパネル押出 L-eGFP/(L)8を示しています-トリス ソリューション ハイドロゲルを用いた。はめ込み L-eGFP/(L)8の拡大画像が表示されます-ハイドロゲルを用いた。径分布は ± 8 μ m 帯 552、重合 (558 μ m) の間に使用される PFTE 管の内部の直径との合意です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 力クランプ レオメータの設計およびセットアップします。(A) 組み立てられた力クランプ ハイドロゲル レオメータのレンダリング。蛋白質ベースのゲル サンプル添付の声にはめ込み番組とコイル ソリューション室内センサー フックを強制します。(B) 力クランプ ハイドロゲル レオメータの分解ビューのレンダリング: (c) xyzマニピュレーター音声コイルを調整するためフックの位置、(d) 線形ボイスコイル モーター、(e) 力変換器、(f) 力探触子ホルダー、(g) ソリューション室と (h - 私) x・yマニピュレーター力探触子の位置を調整するため。力クランプ ハイドロゲル レオメータ セットアップの (C) 方式です。スキームは力センサーに接続されている蛋白質ベースのゲルのサンプルを示し、ボイスコイル フック医療用縫合糸を使用します。アナログ PID システムは、力セット ポイントに従うボイスコイル位置を調整することによりハイドロゲルの長さを変更します。(D) PID システム応答力に到達する (私) 別の積分ゲイン値を使用しては、ポイント (破線) を設定します。測定力 (下) で表し、ひずみ (top) に由来する色つきトレース PID システム応答。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: L-eGFP/(L)8-ベースのハイドロゲル添付プロセス。(A) クローズ アップをフックにゲルのサンプルを添付するために使用、緩いダブルオーバーハンド ノットと結ばれる縫合糸ループの表示。(B) 2 つの縫合糸のループは、ハイドロゲルの蛋白質ベースの添付ファイルで使用されるフォース センサー フックに配置されます。(C)、L-eGFP/(L)8-ベースのゲルのサンプルが (矢印によって示されます) フック間ハングしました。(D) ボイスコイル (左) 側に縫合糸のループし、サンプルの測定中に滑りを防ぐために各フックのベンドのハイドロゲル サンプル周囲力センサー フック (右) に張られました。その後、余分な縫合は医療はさみ (赤い矢印で示されます) を使用してトリムされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
L-eGFP/(L)8の図 4: 代表的な力ランプ測定とデータ解析曲線-ベース ハイドロゲル サンプル。(A) 代表的なスラック測定曲線 (赤) 力センサーのゼロの力と、ハイドロゲルの実際の長さを決定するために使用します。どちらの政権に合わせて 2 つの線形曲線 (青とオレンジ色の線) を使用: 最初に、ゲルは力 (青線)、下と 2 番目、ゲルに変わったら余裕期間 (高原 - オレンジ ライン)。2 本の線の交差部分を使用して、ゼロの力で真のハイドロゲルの長さを計算します。矢印は、動きの方向を示しています。はめ込みは、ゼロの力の場所およびハイドロゲルの長さの補正を示します。(B) 代表的な力ランプ曲線ハイドロゲル サンプルに適用されます。(C) トレース時間の関数としてコイルの位置の動きを表します。コイルは、ステップ 3.1 (7.5 mm) でプロトコルで定義されている最初の位置から開始します。(D) ゲル サンプルを時間の関数としての拡張機能の代表的な曲線。拡張機能は、変位測定コイル位置と初期位置の間として計算されます。(E) 代表ひずみ-対-時間曲線。ひずみは、スラック測定から算定される真のゲルの長さで拡張子を割ることによって計算されます。ハイドロゲル サンプルの (F) 代表的な応力-ひずみ曲線です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 定数力測定とデータ解析します。(A) 代表的な微量ハイドロゲルに適用される定数力プロトコル。ヒドロゲルは 30 の 0.1 mN にさらされる s、それから力は 120 の 1 mN に増加 s、そして最後に、力対トレース 300 聡 (B) このパネルはコイルの位置 h の長さの変化を表す時間 0.1 mN に戻る焼入れがydrogel サンプル力プロトコルに従います。(C) このパネルは、ボイスコイルの変位から測定したゲルの拡張機能を示します。(D) ストレス (下) とデータ解析後ひずみ跡 (上) の代表的な図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで、低ボリューム蛋白質ベースのゲルの力学的応答特性を調査する力クランプ ワイヤ手法について述べる。また、制服の円筒低ボリューム蛋白質ゲルのサンプルを合成するプロトコルが提供されます。フックで任意の力学的変形または蛋白質ベースのゲルのサンプルやゲルの滑りの損傷を引き起こすことがなく各種の弾力性と蛋白質ベースのゲルの種類の結び方を記述するプロトコルについて述べる。線形音声コイルおよび力センサー、アナログ PID システムは力のランプなど一定の力制御プロトコルのアプリケーションを有効にします。最近では、さまざまな実験的ソリューション7における BSA ベース ヒドロゲル濃度の異なる架橋の力学的応答特性を研究するこの手法が使用されています。
策定タンパク質ハイドロゲルと作業するときの重要な側面は、測定の再現性です。ゲルには、あまりにも低たんぱく濃度または不完全な架橋が配合されています、永久的なプラスチック変形が延長7時に表示されます。これらの変形はだろう粘弾性効果ドメイン展開とゲル内分子再配列の両方から来るデータ解釈を大幅に制限。場合を参照してください簡単なテストが完了 6 M ため塩化1などの化学変性剤でゲルを浸すには架橋します。この場合、べきである任意の粘弾性の効果で、応力-対-ひずみ曲線、すべてのドメインは、化学的に折り畳まれたは、分子が今、単純なポリマー4,7,26として振る舞っています。さらに、ゲルは、初期バッファー7に戻って漬して初期弾力性を回復するべき。
トラブルシューティングのいくつかの側面を考慮すべき別のゲルで得られたトレース間の測定された応答に変化がある場合、: 架橋と蛋白質の非均質混合溶液中の蛋白質の集合化学薬品、不適切なシリル化による PFTE 管タンパク質ハイドロゲルのバインディング、気泡の存在。管壁にシランの残基がヒドロゲルを汚染し、構造上の欠陥に 。このエラーを避けるためより多くの圧縮空気はチューブからシランの総除去を確保するため必要です。さらに、PTFE チューブにゲル光ミックスの吸引中に気泡を形成できます。これらの気泡は、損傷のサンプルし、ゲルの力学的応答特性に影響を与える可能性があります。任意の気泡を防ぐためには、PTFE チューブの先端ソリューション ミックス中読み込み処理中にする必要があります、シリンジのプランジャーをゆっくりと撤回する必要があります。もう一つの典型的なエラーは、締めすぎハイドロゲル サンプル周り縫合糸ループのノッチの形成と、ハイドロゲルの切断につながる可能性があります添付ファイルの処理中に。音声コイルの移動範囲を制限添付ハイドロゲル サンプルの最大延長します。この制限は数百を拡張するゲルを測定する場合を考慮する、彼らの初期の長さのパーセント。たとえば、200% 以上のハイドロゲルを拡張する 4 mm 未満の初期の長さが必要です。
蛋白質ベースのゲルは、生体材料の生体適合性と蛋白質、彼らのメインの建物の単位および蛋白質の特徴である固有の折り畳み転移から派生した高延伸のためのユニークなクラスです。さらに、これらのゲルには、ティッシュ エンジニア リング、ドラッグデリバリー システム、生物学的インク (bioink) 3 D 印刷27に優秀な可能性があります。力クランプ ハイドロゲル レオメーターは、蛋白質の大きい変化を調査する使用できます。さらに、クランプ力レオメーターは、低ボリューム ハイドロゲル サンプル上の定数力プロトコルのアプリケーションをできます。これらの実験は、弾性および粘弾性挙動のデカップリングを許可し、一括アプローチ (国連) 折りたたみ機構を研究します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は研究成長イニシアチブ (賞号 X 340 101)、全米科学財団、主要なインストルメンテーション研究グラント号からの財政支援を認めるPHY-1626450)、大きいミルウォーキー財団 (ショウ賞) とウィスコンシン大学システム (応用研究グラント)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
- Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins? Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
- Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
- Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
- Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
- Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
- Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
- Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
- Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
- Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
- Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface? Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
- Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
- Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
- Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
- Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).
- Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
- Desai, M. S., et al.
- Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
- McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
- Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
- Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
- Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
- Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
- Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).
