التصوير إنتغرين التوتر وقوة الخلوية في القرار Submicron مع جهاز استشعار توتر التكاملية
Summary
التوتر إنتغرين تلعب أدواراً هامة في مختلف وظائف الخلية. مع جهاز استشعار توتر تكاملية، معايرة بحساسية بيكونيوتون (pN) إنتغرين التوتر وتصويرها في القرار submicron.
Abstract
هو التوتر الجزيئية المرسلة بواسطة السندات إنتغرين-يجند الإشارات الميكانيكية الأساسية في المسار إنتغرين التي تضطلع بأدوار هامة في العديد من وظائف الخلية والسلوكيات. لمعايرة والصورة إنتغرين التوتر مع حساسية عالية القوة والقرار المكانية، قمنا بتطوير جهاز استشعار توتر تكاملية (البحث عن)، جهاز استشعار توتر فلورية القائمة على الحمض النووي. يتم تنشيط البحث عن فلوريس إذا إدامة توتر جزيئية، وبالتالي تحويل القوة إلى إشارة مضيئة على المستوى الجزيئي. عتبة التوتر عن التنشيط الانضباطي في النطاق من 10 – 60 pN جيدا يغطي النطاق الديناميكي للتوتر إنتغرين في الخلايا. على الركازة المطعمة بالبحث عن، تصور بالأسفار التوتر إنتغرين الخلايا ملتصقة وتصويرها في القرار submicron. البحث عن أيضا متوافقة مع التصوير الهيكلي الخلية في الخلايا الحية والخلايا الثابتة. البحث عن طبق بنجاح دراسة تقلص الصفائح الدموية والهجرة الخلية. هذه الورقة تفاصيل الإجراء للتوليف وتطبيق لها في الدراسة المنقولة إنتغرين القوة الخلوية.
Introduction
الخلايا تعتمد على إينتيجرينس الالتزام وبذل القوات الخلوية للمصفوفة خارج الخلية. نقل الخلية بوساطة إنتغرين الالتصاق والقوة حاسمة بالنسبة للخلية التي تنتشر الهجرة3،4،1،2وبقاء5،،من67. على المدى الطويل، إنتغرين مما يشير إلى النشاط الحيوي أيضا يؤثر على خلية انتشار8،،من910 والتمايز11،12. قد طور الباحثون أساليب مختلفة لقياس والخريطة المنقولة إنتغرين الخلوية قوات في واجهة الخلية-مصفوفة. وتستند هذه الطرق التحتية المرنة13، مجموعة من14من micropost، أو ذرية قوة مجهرية (فؤاد)15،16. الطرق التحتية و micropost مرنة تعتمد على تشوه ركائز تقرير الإجهاد الخلوية والقيود فيما يتعلق بالقرار المكانية وقوة حساسية. فؤاد قوة عالية الحساسية، ولكن فإنه لا يمكن الكشف عن القوة في مواقع متعددة في وقت واحد، مما يجعل من الصعب على خريطة القوة الخلوية أحالها إينتيجرينس.
في السنوات الأخيرة، وضعت عدة تقنيات لدراسة القوة الخلوية على المستوى الجزيئي. ووضعت مجموعة من أجهزة الاستشعار الجزيئية التوتر على أساس17،البولي إيثيلين غليكول18وعنكبوت الحرير الببتيد19، والحمض الخلوي الصبغي20،21،،من2223 إلى تصور ورصد التوتر المرسلة بواسطة البروتينات الجزيئية. من بين هذه التقنيات، اعتمد الحمض النووي أولاً كقياس المواد التوليف في التوتر الحبل (TGT)، رابط روبتورابل الذي ينظم الحد الأعلى للتوترات إنتغرين في الخلايا الحية22،24. في وقت لاحق، تقنية نقل صدى الحمض النووي والأسفار تم الجمع بين لخلق دبوس أجهزة استشعار التوتر الفلورسنت على أساس الحمض النووي أولاً تشن المجموعة23 و مجموعة ساليتا في20. جهاز استشعار التوتر القائم على الحمض النووي دبوس تقارير إنتغرين التوتر في الوقت الحقيقي وتم تطبيقه بنجاح على دراسة سلسلة من الوظائف الخلوية21. بعد ذلك، ضم مختبر وانغ TGT مع زوج فلوروفوري-يحتوي تقرير إنتغرين التوتر. يدعى هذا الاستشعار البحث عن25،26. يستند مزدوج تقطعت الحمض النووي (dsDNA) ومجموعة ديناميكية أوسع (10-60 pN) لمعايرة التوتر إنتغرين. على النقيض من دبوس أجهزة الاستشعار على أساس الحمض النووي، البحث عن لا تبلغ قوة الخلوية في الوقت الحقيقي لكن يسجل جميع الأحداث التاريخية إنتغرين كالبصمة الخلوية القوة؛ تحسن هذه العملية تراكم الإشارات حساسية الخلوية قوة التصوير، ويجعلها ممكنة لقوة الصورة الخلوية حتى مع مجهر الأسفار منخفضة. توليف للبحث عن نسبيا أكثر ملاءمة، فإنه يتم إنشاؤه بواسطة التهجين اثنين واحد-الذين تقطعت بهم السبل المعينة (سدنا).
البحث عن دسدنا 18-قاعدة-إقران مترافق مع البيوتين، فلوروفوري، تقضي (الثقب الأسود يحتوي 2 [BHQ2])27، و دوري أرجينيلجليسيلاسبارتيك حمض (إدارات) ببتيد28 يجند ببتيد إنتغرين (الشكل 1). حبلا أقل هو مترافق مع فلوروفوري (Cy3 ويستخدم في هذه المخطوطة، بينما الأصباغ الأخرى، مثل سلسلة Cy5 أو أليكسا، ثبت عمليا في المختبر لدينا أيضا) والعلامة البيوتين، التي هي معطلة البحث عن على الركازة بالسندات avidin البيوتين. ستراند العلوي هو مترافق مع إدارات الببتيد و “تقضي الثقب الأسود”، الذي يروي Cy3 مع حوالي 98 ٪ التبريد الكفاءة26،27. مع البروتوكول المعروضة في هذه الورقة، كثافة الطلاء لها على الركازة حول 1,100/ميكرون2. وهذا هو كثافة نحن معايرة سابقا عن 18 شركة بريتيش بتروليوم بيوتينيلاتيد دسدنا المغلفة على الركازة فونكتيوناليزيد نيوترافيدين باتباع نفس طلاء بروتوكول29. عندما تلتزم الخلايا الركيزة مغطاة البحث عن، يربط لها من خلال إدارات إنتغرين وينقل التوتر إلى البحث عن. وقد البحث عن توتر محددة تسامح (تيتول) الذي يعرف بأنه على عتبة التوتر الذي يفصل ميكانيكيا دسدنا لها داخل 2 ق22. تمزق سبب التوتر إنتغرين يؤدي إلى فصل يحتوي من الصبغة التي تنبعث الأسفار فيما بعد. نتيجة لذلك التوتر إنتغرين غير مرئية يتم تحويلها إلى إشارة الأسفار ويمكن تعيين قوة الخلوية بتصوير الأسفار.
لبيان تطبيق للبحث عن، نستخدم الأسماك كيراتوسيتي هنا، نموذج خلية مستخدمة على نطاق واسع للخلية الهجرة دراسة30،،من3132، الخلية K1 تشو، خط الخلية نونموتيلي استخداماً، وتنتجها الخلايا الليفية 3T3 المعاهد الوطنية للصحة. ويجري أيضا كويماجينج إنتغرين الهياكل التوتر والخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
البحث عن هو الوصول للغاية بعد قوة تقنية قوية للخلوي التعيين من حيث التوليف والتطبيق. مع جميع المواد جاهزة، يمكن توليفها البحث عن إطار يوم 1. خلال التجارب، هناك حاجة فقط ثلاث خطوات لطلاء السطح قبل الطلاء الخلية. في الآونة الأخيرة، نحن كذلك تبسيط الإجراءات طلاء إلى خطوة واحدة بربط مباشرة الب?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها الصندوق بدء التشغيل المقدمة من جامعة ولاية آيوا والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (R35GM128747).
Materials
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
Riferimenti
- Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
- Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
- Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
- Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
- Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
- Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
- Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
- Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
- Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
- Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
- Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
- Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).
- Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
- Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
- Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
- Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
- Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
- Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
- Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
- Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
- Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
- Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
- Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
- Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
- Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
- Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
- Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
- Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
- Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
- Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
- Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
- de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences – Series IV – Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
- Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).
