Integrin 긴장과 셀룰러 힘 통합 긴장 센서와 서브 마이크론 해상도 이미징
Summary
Integrin 긴장 다양 한 세포 기능에 중요 한 역할을 담당합니다. 통합 긴장 센서 integrin 긴장은 picoNewton (pN) 감도 보정와 서브 마이크론 해상도 몇 군데.
Abstract
Integrin 리간드 결합에 의해 전송 분자 긴장은 많은 세포 기능 및 동작에 중요 한 역할을 재생 integrin 통로에 근본적인 기계 신호입니다. 보정 고 integrin 긴장 높은 힘 감도와 해상도 이미지, 우리는 통합 긴장 센서 (ITS), 형광 긴장 DNA 기반 센서 개발. ITS 힘 분자 수준에서 형광 신호에 따라서 변환 형광 분자 긴장을 유지 하는 경우에 활성화 됩니다. ITS 활성화에 대 한 긴장 임계값은 10-60 pN 잘 셀에서 integrin 긴장의 동적 범위를 커버 하는 범위에서 조정할 수 있습니다. ITS와 융합 하는 기판에 부착 세포의 integrin 긴장 형광에 의해 시각 이며 서브 마이크론 해상도 몇 군데. ITS는 또한 라이브 셀에 고정된 셀 셀 구조 이미징에 호환 됩니다. ITS는 혈소판 수축 및 세포의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. 이 문서는 합성 및 ITS integrin 전송 셀룰러 힘의 연구에의 응용에 대 한 절차를 자세히 설명합니다.
Introduction
셀은 integrins 준수 및 셀룰러 힘 세포 외 기질을 발휘에 의존 합니다. Integrin 중재 하는 세포 접착 및 힘 전송 셀1,2, 마이그레이션3,4및 생존5,,67확산에 대 한 중요 한 있습니다. 긴 기간에 또한 셀 확산8,,910 와 차별화11,12영향 integrin biomechanical 신호. 연구원은 측정 하는 다양 한 방법을 개발 했다 하며 지도 integrin 전송 휴대 세포-매트릭스 인터페이스에서. 이러한 메서드는 탄성 층13, 배열 micropost14또는 원자 힘 현미경 (AFM)15,16. 탄성 층 및 micropost 방법 세포 스트레스를 보고와 공간적 해상도 측면에서 제한이 감도 강제 하는 기판의 변형에 의존 합니다. AFM은 높은 힘 감도, 하지만 그것은 동시에 여러 장소에서 힘을 감지할 수 없습니다, 그리고 integrins 전송한 셀룰러 힘을 지도 하 고 어려운.
최근 몇 년 동안, 여러 기술 분자 수준에서 세포 힘 연구 개발 되었다. 폴 리 에틸렌 글리콜17,18, 거미 실크 펩 티 드19및 DNA20,21,,2223 에 따라 분자 긴장 센서의 컬렉션을 개발 되었다 시각화 하 고 분자 단백질에 의해 전송 하는 긴장을 모니터링 합니다. 이러한 기법 중 DNA 합성 물자는 긴장에 밧줄 (TGT), 변조 라이브 셀22,24integrin 긴장의 상한 rupturable 링커 측정으로 처음 채택 되었다. 나중에, DNA와 형광 공명 전송 기술을 결합 했다 만드는 머리 핀 형광 긴장 DNA 기반 센서 먼저 첸의 그룹23 , Salaita의 그룹20여. 헤어핀 긴장 DNA 기반 센서 integrin 긴장 실시간으로 보고 하 고 세포 기능21의 일련의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. 그 후, 왕 실험실 보고서 integrin 긴장 fluorophore 끄는 쌍 한 TGT 결합. 이 센서 는25,26이름은입니다. ITS 이중 가닥 DNA (dsDNA)에 기반 하 고 integrin 긴장 교정에 대 한 광범위 한 동적 범위 (10-60 pN) 있다. 헤어핀 DNA 기반 센서, 달리 ITS 실시간 세포 힘을 보고 하지 않습니다 하지만 셀룰러 힘;의 발자국으로 모든 역사적인 integrin 이벤트 기록 이 신호 축적 과정 영상, 그것을 만드는 가능한 이미지 셀룰러 힘도 저가형 형광 현미경으로 세포 힘에 대 한 감도 향상 시킵니다. ITS의 합성은 두 개의 단일 가닥 DNAs (ssDNA)을 교배 시키기 의해 만들어집니다 더 상대적으로 편리 합니다.
ITS는 18 베이스 결합 dsDNA integrin 펩타이드 리간드 (그림 1)으로 biotin, fluorophore는, 끄는 (블랙 홀을 끄는 2 [BHQ2])27와는 순환 arginylglycylaspartic 산 (RGD) 펩 티 드28 활용 이다. 낮은 물가 fluorophore와 활용 (Cy3 Cy5 또는 알 렉 사 시리즈 다른 염료 동안이 원고에 사용 됩니다, 또한 입증 된 우리의 실험실에서 가능한)는 ITS biotin avidin 본드로 기판에 움직일는 biotin 태그. 위쪽 가닥 RGD 펩타이드와 약 98% 냉각 효율26,27와 Cy3 냉각 블랙홀 끄는 활용 이다. 이 문서에 소개 된 프로토콜, 기판에 ITS의 코팅 밀도 1100 / µ m2주위에 이다. 이것은 우리가 이전 18 혈압 biotinylated dsDNA 같은 프로토콜29코팅에 따라 neutrAvidin 기능성된 기판에 코팅에 대 한 보정 밀도 이다. 셀 ITS 코팅 기판에 준수 때 integrin RGD 통해 ITS 한다 장력 ITS 전송. ITS는 기계적으로 분리 2 s22내 ITS의 dsDNA 긴장 임계값으로 정의 된 특정 긴장 공차 (T톨). Integrin 긴장으로 그것의 파열 리드는 끄는의 분리 이후 형광을 방출 하는 염료에서. 결과적으로, 보이지 않는 integrin 긴장 형광 신호에 변환 되 고 셀룰러 힘 형광 이미징으로 매핑할 수 있습니다.
ITS의 응용 프로그램 입증, 우리 물고기 keratocyte 여기, 셀 마이그레이션 연구30,,3132널리 셀 모델, 조-K1 셀, 일반적으로 사용 되는 nonmotile 셀 라인, 및 NIH 3T3 섬유를 사용 합니다. Integrin 긴장과 셀 구조의 coimaging는 또한 실시 하 고 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
ITS는 휴대에 대 한 강력한 기술 강제로 합성 및 응용 프로그램 매핑 아직 매우 액세스할 수 있습니다. 모든 재료 준비, 1 일 이내 ITS는 합성 수 있습니다. 실험, 동안 표면 코팅의 3 단계 셀 도금 전에 필요 합니다. 최근, 우리는 더 ITS 소 혈 청 알 부 민, 유리 또는 폴리스 티 렌 표면33ITS의 직접적인 물리적 흡착 수에 직접 연결 하 여 한 단계로 코팅 절차를 단순화. ITS는 셀룰러 구조 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 아이오와 주립 대학 그리고에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 (R35GM128747) 제공 시작 기금에 의해 지원 되었다.
Materials
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
Riferimenti
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