Proyección de imagen integrina tensión y fuerza celular en la resolución del Submicron con un Sensor de tensión integradora
Summary
Integrina tensión juega un papel importante en diversas funciones celulares. Con un sensor de tensión integradora, integrina tensión es calibrada con sensibilidad picoNewton (pN) y reflejada en la resolución del submicron.
Abstract
La tensión molecular transmitida por bonos de integrina ligando es la señal mecánica fundamental en la vía de la integrina que juega un papel importante en muchas funciones celulares y los comportamientos. Para calibrar y tensión de integrina de la imagen con fuerza alta sensibilidad y resolución espacial, se desarrolló un sensor de tensión integradora (ITS), un sensor de tensión fluorescente basado en el ADN. El su se activa para emitir fluorescencia si mantener una tensión molecular, así conversión de fuerza a la señal fluorescente a nivel molecular. El umbral de tensión para su activación es ajustable en el rango de pN 10 – 60 que cubre bien el rango dinámico de tensión de integrinas en las células. Sobre un sustrato injertado con una ITS, la tensión de integrinas de las células adherentes es visualizada por fluorescencia y reflejada en la resolución del submicron. El ITS también es compatible con la proyección de imagen estructural de célula en células fijas y células vivas. El ITS se ha aplicado con éxito al estudio de la migración celular y la contracción de la plaqueta. Este documento detalla el procedimiento para la síntesis y aplicación de lo ITS en el estudio de la fuerza celular integrina-transmitida.
Introduction
Las células dependen de las integrinas cumplir y ejercer fuerzas celulares a la matriz extracelular. Transmisión de fuerza y adhesión celular mediada por integrinas son cruciales para la célula de difusión de1,2, migración3,4y supervivencia5,6,7. En el largo plazo, integrina biomecánica señalización también influye célula proliferación8,9,10 y diferenciación11,12. Los investigadores han desarrollado varios métodos para medir y celular integrina transmitida mapa las fuerzas en la interfase célula-matriz. Estos métodos se basan en sustrato elástico13, matriz de micropost14, o atómica microscopía (AFM)15,16de la fuerza. Métodos elásticos de sustrato y micropost dependen de la deformación de sustratos a informe el estrés celular y tienen limitaciones en términos de resolución espacial y sensibilidad de la fuerza. AFM tiene fuerza de alta sensibilidad, pero no puede detectar la fuerza en puntos múltiples simultáneamente, haciendo difícil mapa celular fuerza transmitida por las integrinas.
En los últimos años, se desarrollaron varias técnicas para estudiar la fuerza celular a nivel molecular. Una colección de sensores de tensión molecular basados en glicol de polietileno17,18, péptido de seda de araña19y ADN20,21,22,23 fueron desarrolladas para visualizar y monitorizar la tensión transmitida por las proteínas moleculares. Entre estas técnicas, DNA primero fue adoptado como el material de síntesis en la tensión de la correa (TGT), un enlazador rupturable que modula el límite de las tensiones de la integrina en células vivas22,24. Más tarde, técnica de transferencia de ADN y fluorescencia resonancia se combinan para crear horquilla sensores basados en ADN fluorescente tensión primero por Chen grupo23 y grupo20 de Salaita. El sensor de tensión basado en el ADN de horquilla informes integrina tensión en tiempo real y ha sido aplicado con éxito al estudio de una serie de funciones celulares21. Después, laboratorio de Wang había combinado un TGT con el par fluoróforo-extintor a tensión de integrina de informe. Este sensor lleva un su25,26. El ITS se basa en ADN de doble cadena (dsDNA) y tiene un rango dinámico más amplio (pN 10-60) para la calibración de la tensión de la integrina. En contraste con sensores basados en el ADN de la horquilla, el su informe no fuerza celular en tiempo real pero registra todos los acontecimientos histórico integrinas como la huella de la fuerza celular; Este proceso de acumulación de señal mejora la sensibilidad para la fuerza celular imágenes, lo que es factible a fuerza celular imagen incluso con un microscopio de fluorescencia bajo. La síntesis de ITS es relativamente más conveniente que se constituya por cruzamiento por hibridación dos ADN monocatenario (ssDNA).
El ITS es un dsDNA 18-base-emparejado conjugado con biotina, un fluoróforo, un extintor (Black Hole Quencher 2 [BHQ2])27y un arginylglycylaspartic cíclico ácido (RGD) péptido28 como un ligando de péptido de integrina (figura 1). El hilo inferior se conjuga con el fluoróforo (Cy3 se utiliza en este manuscrito, mientras que otros tintes, tales como serie del Cy5 o Alexa, también se han demostrado viables en nuestro laboratorio) y la etiqueta de biotina, con el que el su es inmovilizado sobre un sustrato por enlace biotina-avidina. El hilo superior se conjuga con el péptido RGD y el Quencher del agujero negro, que sacia Cy3 con aproximadamente 98% amortiguamiento eficiencia26,27. Con el protocolo presentado en este trabajo, la densidad de la capa de su substrato es alrededor de 1.100/μm2. Esto es la densidad que previamente calibrados para 18 bp biotinilado dsDNA cubierto sobre el sustrato funcionalizados neutrAvidin siguiendo el mismo protocolo29de la capa. Cuando las células se adhieren al substrato cubierto con el su, integrina une el ITS a través de RGD y transmite la tensión a la su. El su tiene una tolerancia de tensión específico (Ttol) que se define como el umbral de tensión que separa mecánicamente el dsDNA de ITS dentro de 2 s22. SU ruptura por tensión de integrina conduce a la separación del extintor de la tintura que posteriormente emite fluorescencia. Como resultado, la tensión de la integrina invisible se convierte en una señal de fluorescencia y la fuerza celular puede asignarse por proyección de imagen de fluorescencia.
Para demostrar la aplicación de lo ITS, utilizamos peces keratocyte aquí, un modelo de celular utilizado para celular migración estudio30,31,32, células CHO-K1, utilizado células inmóviles y fibroblastos 3T3 de NIH. Coimaging de las estructuras de tensión y celular integrina también se lleva a cabo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ITS es muy accesible pero poderosa técnica para celulares asignación en términos de síntesis y aplicación de la fuerza. Con todos los materiales listos, el ITS pueden ser sintetizado dentro de 1 día. Durante los experimentos, se necesitan sólo tres pasos de la capa superficial antes de la galjanoplastia de la célula. Recientemente, lo más habían simplificado el procedimiento de recubrimiento para un paso vinculando directamente el su con albúmina de suero bovino, lo que permite la adsorción física directa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el fondo de arranque proporcionado por la Universidad Estatal de Iowa y por el Instituto Nacional del General médica Ciencias (R35GM128747).
Materials
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
Riferimenti
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