Tensione di integrina svolge i ruoli importanti in varie funzioni cellulari. Con un sensore di tensione integrativa, integrina tensione è calibrato con sensibilità picoNewton (pN) e ripreso a risoluzione di submicron.
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Articolo metodologico
Tensione di integrina e cellulare forza alla risoluzione di Submicron con un sensore di tensione integrativa di imaging
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molecolare tensione trasmessa dal ligando integrinico obbligazioni è il segnale meccanico fondamentale nella via dell'integrina che gioca un ruolo importante in molte funzioni cellulari e comportamenti. Per calibrare e integrina tensione della battuta con forza elevata sensibilità e risoluzione spaziale, abbiamo sviluppato un sensore di tensione integrativa (ITS), un sensore di tensione fluorescente basati sul DNA. L'ITS viene attivato per essere flourescente se sostenere una tensione molecolare, così convertire forza segnale fluorescente a livello molecolare. La soglia di tensione per l'attivazione di ITS è accordabile nell'intervallo di pN 10 – 60 che ben copre la gamma dinamica della tensione delle integrine in cellule. Su un substrato innestato con un ITS, la tensione di integrin di cellule aderenti è visualizzata tramite fluorescenza ed imaged a risoluzione di submicron. L'ITS è anche compatibile con formazione immagine strutturale delle cellule in cellule vive e cellule fissate. L'ITS è applicato con successo per lo studio della contrazione delle piastrine e migrazione cellulare. Questa carta in dettaglio la procedura per la sintesi e l'applicazione dell'ITS nello studio della forza cellulare integrina-trasmessa.
Introduzione
Le cellule si basano sulle integrine di aderire ed esercitano forze cellulare alla matrice extracellulare. Trasmissione di adesione e forza di integrina-mediata delle cellule sono cruciali per cella diffusione1,2, migrazione3,4e sopravvivenza5,6,7. A lungo termine, integrina biomeccanico segnalazione influenza anche cellula proliferazione8,9,10 e differenziazione
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di uso (IACUC, 8-16-8333-I) della Iowa State University e istituzionali Animal Care.
1. sintesi del sensore tensione integrativa
- Personalizzare e ordinare ssDNAs (Vedi la Tabella materiali).
Nota: Le sequenze di ssDNA sono come segue. Il filo superiore è /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. I fili inferiori sono come segue.
12 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio/
23 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT/ CCC
33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
pN 54 ITS....
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Risultati
Con l'ITS, la mappa di tensione integrina dei keratocytes di pesce è stata catturata. Dimostra che un keratocyte migra e genera tensione integrina alle due tracce di forza (Figura 2A). La risoluzione della mappa forza è stata calibrata per essere 0,4 µm (Figura 2B). Integrina alta tensione si concentra sul margine posteriore (Figura 3A). L'ITS Mostra anche diversi modelli specifici di cellule diverse.......
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Discussione
L'ITS è un altamente accessibile ma potente tecnica per cellulare mappatura in termini sia di sintesi e di applicazione della forza. Tutti i materiali pronti, l'ITS può essere sintetizzato entro 1 giorno. Durante gli esperimenti, sono necessari solo tre passaggi di rivestimento superficiale prima della placcatura di cella. Recentemente, abbiamo ulteriormente semplificato la procedura di rivestimento per un passo collegando direttamente il suo di albumina di siero bovino, che consente di adsorbimento fisico diretto dell'I.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal fondo di avvio fornito da Iowa State University e dal National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BSA-biotina | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| filamento superiore DNA | Tecnologie DNA integrate | N/A | Progettato dal cliente. La sequenza del DNA è mostrata nella sezione PROTOCOLLO |
| filamento inferiore DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | progettato dal cliente. Le sequenze di DNA sono mostrate nella sezione PROTOCOLLO. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Peptide ciclico RGD con un gruppo amminico | Peptidi Internazionale | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillina | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL piastra di Petri | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | Spettrometro N/A | |
| SE410 Unità di elettroforesi proteica verticale raffreddata ad aria alta | Hoefer | SE410-15-1.5 | Dispositivo per elettroporesi |
| Linea cellulare CHO-K1 | ATCC | CCL-61 | |
| Linea cellulare NIH/3T3 | ATCC | CRL-1658 | |
| Anticorpo anti-vincolina | EMD Millipore | 90227 | Anticorpo primario per l'immunocolorazione della vincolina |
| Anticorpo secondario superclonale IgG di capra (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Anticorpo secondario per l'immunocolorazione con vinculina |
| Alexa Fluor 647 Falloidina | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscopio |
Riferimenti
- Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal ....
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Ristampe e permessi
