Imaging-Integrin Spannung und zelluläre Kraft mit Submicron-Auflösung mit einem integrativen Spannung Sensor
Summary
Integrin Spannung spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Zellfunktionen. Mit einem integrativen Spannung Sensor ist Integrin Spannung mit Pikonewton (pN) Empfindlichkeit kalibriert und mit Submikron Auflösung abgebildet.
Abstract
Molekulare Spannung übertragen durch Integrin-Ligand-Bindungen ist das grundlegende mechanische Signal in der Integrin-Weg, der bedeutende Rollen in vielen Zellfunktionen und Verhaltensweisen spielt. Zur Kalibrierung und Bild Integrin Spannung mit hoher Kraft Sensibilität und räumliche Auflösung, haben wir einen integrative Spannung Sensor (ITS), ein DNA-basierte fluoreszierende Spannung Sensor entwickelt. Der ITS ist aktiviert, um fluoreszieren, wenn eine molekulare Spannung aufrechterhalten Fluoreszenzsignal auf molekularer Ebene dadurch Kraft umwandeln. Die Spannung Schwelle für ITS-Aktivierung ist einstellbar im Bereich von 10 – 60 pN, die den Dynamikbereich des Integrin-Spannung in den Zellen gut abdeckt. Auf einem Substrat mit einem ITS veredelt ist die Integrin-Spannung von adhärenten Zellen durch Fluoreszenz visualisiert und mit Submikron Auflösung abgebildet. Der ITS ist auch kompatibel mit Zelle strukturelle Bildgebung in lebenden Zellen und festen Zellen. Der ITS hat sich dem Studium der Thrombozyten Kontraktion und Zellwanderung erfolgreich angewendet. Dieses Papier beschreibt das Verfahren für die Synthese und Anwendung von IVS in der Erforschung der zellulären Kraft Integrin-übertragen.
Introduction
Zellen setzen auf Integrine zu halten und zelluläre Kräfte zur extrazellulären Matrix auszuüben. Integrin-vermittelte Zelle Adhäsion und Kraft Übertragung sind entscheidend für die Zelle verbreiten,1,2, Migration3,4und überleben5,6,7. Auf lange Sicht beeinflusst das Integrin biomechanische Signalisierung auch Zelle Verbreitung8,9,10 und Differenzierung11,12. Forscher entwickelten verschiedene Methoden zur Messung und Karte Integrin übertragbare Mobilfunk Kräfte an der Zellmatrix Schnittstelle. Diese Methoden basieren auf elastischen Substrat13, Array von Micropost14, oder atomic force Microscopy (AFM)15,16. Elastische Substrat und Micropost Methoden beruhen auf der Verformung von Substraten zu berichten die zellulären Stress und haben Einschränkungen in Bezug auf räumliche Auflösung und Empfindlichkeit zu erzwingen. AFM hat hohe Kraftempfindlichkeit, aber es nicht Kraft an mehreren Stellen gleichzeitig erkennen, erschwert das zelluläre Kraft Karte durch Integrine übertragen.
In den letzten Jahren wurden verschiedene Techniken entwickelt, um zelluläre Kraft auf molekularer Ebene zu untersuchen. Eine Sammlung von molekularen Spannung Sensoren basierend auf Polyethylenglykol17,18, Spinne Seide Peptid19und DNA-20,21,22,23 wurden entwickelt, um visualisieren Sie und überwachen Sie Spannung durch molekulare Proteine übertragen. Unter diesen Techniken wurde DNA zuerst angenommen, da die Synthese Material in der Spannung messen Tether (TGT), ein rupturable Linker, der die Obergrenze der Integrin Spannungen in lebenden Zellen22,24moduliert. Später, DNA und Fluoreszenz-Resonanz-Transfertechnik wurden kombiniert, um Haarnadel fluoreszierende Spannung DNA-basierte Sensoren erstellen zuerst nach Chens Gruppe23 und Salaitas Gruppe20. Die Haarnadel DNA-basierte Spannung Sensor berichtet Integrin Spannung in Echtzeit und dem Studium einer Reihe von zellulären Funktionen21erfolgreich angewendet wurde. Danach kombiniert Wangs Lab ein TGT mit dem Fluorophor-Quencher paar Bericht Integrin Spannung. Dieser Sensor ist ein ITS25,26benannt. Der ITS basiert auf doppelsträngige DNA (DsDNA) und hat einen breiteren Dynamikbereich (10-60 pN) für Integrin Spannung Kalibrierung. Im Gegensatz zur Haarnadel DNA-basierte Sensoren ITS meldet keine zelluläre Kraft in Echtzeit sondern zeichnet alle historischen Integrin-Ereignisse wie der Fußabdruck von zellulären Kraft; Dieses Signal Akkumulationsprozess verbessert die Empfindlichkeit für zelluläre Kraft imaging, so dass es möglich ist Bild zellulären Kraft sogar mit einem Low-End Fluoreszenzmikroskop. Die Synthese von IVS ist relativ bequemer, wie es durch Hybridisierung zwei einzelsträngigen DNA (SsDNA) erstellt wird.
Der ITS ist ein 18-Basis gepaart DsDNA konjugiert mit Biotin, ein Fluorophor, einen Quencher (Schwarzloch Quencher 2 [BHQ2])27und eine zyklische Arginylglycylaspartic Säure (RGD) Peptid28 als ein Integrin-Peptid-Liganden (Abbildung 1). Der untere Strang ist mit dem Fluorophor konjugiert (Cy3 in dieser Handschrift, während andere Farbstoffe wie Cy5 oder Alexa-Serie verwendet wird, sind auch möglich in unserem Labor nachgewiesen worden) und das Biotin-Tag, mit denen der ITS wird auf einem Substrat von Biotin-Avidin Bond immobilisiert. Der obere Strang ist konjugiert mit RGD-Peptid und das Schwarzloch Quencher, die Cy3 mit ca. 98 % abschrecken Effizienz26,27stillt. Mit dem Protokoll in diesem Papier präsentiert ist die Beschichtung Dichte des ITS auf einem Substrat um 1.100/µm2. Dies ist die Dichte, die wir zuvor für 18 bp biotinylierte DsDNA auf dem NeutrAvidin funktionalisiert Substrat durch Anschluss an das gleiche Protokoll29Beschichtung beschichtet kalibriert. Wenn Zellen auf das Substrat beschichtet mit dem ITS anhaften, Integrin bindet den ITS durch RGD und überträgt Spannungen an den ITS. Der ITS hat eine bestimmte Spannung Toleranz (TTol) definiert als die Spannung Schwelle, die mechanisch die DsDNA des ITS innerhalb von 2 s22trennt. DER Bruch durch Integrin Spannung führt zur Trennung von der Quencher aus der Farbstoff, der anschließend Fluoreszenz emittiert. Infolgedessen die unsichtbare Integrin-Spannung ist ein Fluoreszenzsignal umgewandelt und die zelluläre Kraft durch Fluoreszenz-Bildgebung abgebildet werden kann.
Um die Anwendung des ITS zu demonstrieren, verwenden wir Fisch auch hier, eine weit verbreitete Zellmodell für Zelle Migration Studie30,31,32CHO-K1-Zelle, eine häufig verwendete nonmotile Zelllinie und NIH-3 t 3-Fibroblasten. Coimaging Integrin Spannung und Zelle Strukturen wird auch durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der ITS ist eine hochverfügbare, aber dennoch leistungsfähige Technik für zellulares zwingen Zuordnung im Hinblick auf die Synthese und Anwendung. Mit allen Materialien bereit kann der ITS innerhalb 1 Tages synthetisiert werden. Während der Experimente sind nur drei Schritte der Oberflächenbeschichtung vor der Zelle Beschichtung erforderlich. Vor kurzem haben wir weiter vereinfacht Coating-Verfahren für einen Schritt durch direkte Verknüpfung des ITS zu Rinderserumalbumin, ermöglicht direkte physikalische Adsorpt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Gründerfonds zur Verfügung gestellt von der Iowa State University und durch das National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747) unterstützt.
Materials
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
Riferimenti
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