הדמיה אינטגרין מתח וכוח הסלולר ברזולוציה כחיוניים עם חיישן המתח אינטגרטיבית
Summary
אינטגרין המתח ממלא תפקידים חשובים פונקציות שונות של התא. עם חיישן המתח אינטגרטיבית, המתח אינטגרין מכויל עם רגישות picoNewton (pN), עם תמונה ברזולוציה כחיוניים.
Abstract
מתח מולקולרית המועברת על ידי אינטגרין-ליגנד חוב זה האות מכני בסיסי במסלול אינטגרין שמשחק תפקידים משמעותיים בתוך התא פונקציות רבות התנהגויות. כדי לכייל תמונה אינטגרין מתח עם רגישות גבוהה כוח והרזולוציה המרחבית, פיתחנו חיישן המתח אינטגרטיבית (ITS), חיישן המתח פלורסנט מבוסס DNA. ITS מופעל כדי לזרוח אם הסדירה מתח מולקולרית, ובכך המרת כוח לאות פלורסנט ברמה המולקולרית. סף המתח להפעלה ITS הוא tunable בטווח של 10 – 60 pN שמכסה היטב את הטווח הדינמי של אינטגרין המתח בתאים. על מצע הושתל עם ITS, המתח אינטגרין של תאים חסיד דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית, עם תמונה ברזולוציה כחיוניים. ITS הוא גם תואם תא המבניות תאים חיים והן תאים קבוע. ITS יושם בהצלחה לחקר נדידת תאים להתכווצות של טסיות. מאמר זה מפרט את ההליך עבור סינתזה של יישום ITS במחקר של אינטגרין מסר כוח הסלולר.
Introduction
תאים להסתמך על אינטגרינים כדי לדבוק ולהפעיל כוחות הסלולר מטריצה חוץ-תאית. שידור אדהזיה וכוח בתיווך אינטגרין תא מכריעים עבור תא הפצת1,2,3,ההעברה4והישרדות5,6,7. בטווח הארוך, איתות biomechanical אינטגרין גם השפעות תא התפשטות8,9,10 ובידול11,12. חוקרים פיתחו שיטות שונות למדידת וכוחות מפה מסר אינטגרין סלולרי-הממשק תא-מטריקס. שיטות אלה מבוססות על תשתית גמישה13, מערך micropost14, או אטומי בכוח מיקרוסקופ (AFM)15,16. תשתית גמישה ושיטות micropost להסתמך על להרכב של סובסטרטים הדו ח הלחץ הסלולר, יש מגבלות מבחינת רזולוציה מרחבית, להכריח את הרגישות. AFM יש רגישות גבוהה כוח, אבל הוא אינו יכול לזהות כוח בנקודות מרובים בו זמנית, ולכן קשה למפות כוח הסלולר המועברת על ידי אינטגרינים.
בשנים האחרונות פותחו מספר טכניקות ללמוד הסלולר כוח ברמה המולקולרית. אוסף של חיישנים המתח מולקולרי המבוסס על17,פוליאתילן גליקול18, עכביש משי פפטיד19, ו DNA20,21,22,23 פותחו כדי דמיינו ונטר במתח המועברת על ידי חלבונים מולקולרית. בין שיטות אלה, DNA אומצה לראשונה כמו החומר סינתזה במתח להעריך את הקשר (TGT), rupturable מקשר זאת שמחליש את הגבול העליון של אינטגרין מתחים בתוך תאים חיים22,24. מאוחר יותר, טכניקת העברת DNA ו קרינה פלואורסצנטית תהודה היו המשולבות ליצירת סיכת ראש מבוסס DNA המתח פלורסנט חיישנים לראשונה על ידי קבוצה של חן23 של Salaita קבוצה20. החיישן מבוסס DNA המתח מכבנה מדווח אינטגרין המתח בזמן אמת, יושם בהצלחה במחקר של סדרת פונקציות הסלולר21. לאחר מכן, המעבדה של וואנג בשילוב ש- TGT עם הזוג fluorophore-כ’חטיף דו ח אינטגרין מתח. חיישן זה נקרא25,ITS26. ITS מבוסס על שני גדילי ה-DNA (dsDNA) ויש לו טווח דינמי רחב יותר (10-60 pN) לצורך כיול מתח אינטגרין. בניגוד סיכת ראש מבוסס DNA חיישנים, ITS אינו מדווח כוח הסלולר בזמן אמת אבל יקליט כל האירועים ההיסטוריים אינטגרין טביעת רגלו של כוח הסלולר; תהליך הצטברות אות זה משפר את הרגישות לכוח הסלולר הדמיה, שהופך אותו ריאלי לכוח הסלולר התמונה אפילו עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות זולים. הסינתזה של ITS נוח יחסית יותר כמו זה נוצר על ידי hybridizing חד גדילי שני DNAs (ssDNA).
ITS הוא dsDNA 18-בסיס-לזווג מצומדת עם ביוטין, fluorophore, כ’חטיף (חור שחור כ’חטיף 2 [BHQ2])27arginylglycylaspartic מחזורית חומצה (RGD) פפטיד28 כמו ליגנד פפטיד integrin (איור 1). נמוך יותר סטרנד הוא מצומדת עם fluorophore (Cy3 משמש כתב יד זה, בעוד צבעים אחרים, כגון סדרת Cy5 או אלקסה, גם הוכחו ריאלי במעבדה שלנו) ואת התג ביוטין, שבה ITS ותשמרו על מצע מאת ביוטין-אבידין בונד. סטרנד העליונה היא מצומדת עם פפטיד את RGD, את כ’חטיף חור שחור, אשר המרווה Cy3 עם 98% שכבתה יעילות26,27. פרוטוקול שהוצגו במאמר זה, יש צפיפות ציפוי ITS על מצע בסביבות 1100/מיקרומטר2. זוהי צפיפות שלנו בעבר מכויל עבור 18 dsDNA biotinylated bp מצופה על המצע neutrAvidin functionalized על-ידי ביצוע זהה ציפוי פרוטוקול29. כאשר תאים לדבוק המצע מצופה של ITS, integrin נקשר את ITS דרך RGD ומעביר מתח ITS. ITS יש סובלנות מתח מסוים (Ttol) אשר מוגדר סף המתח שמפריד את dsDNA של ITS בתוך 2 s22מכנית. שלו להיקרע על-ידי מתח אינטגרין מוביל את ההפרדה של כ’חטיף לצבוע את זה לאחר מכן פולט קרינה פלואורסצנטית. כתוצאה מכך, המתח הבלתי נראה אינטגרין המרת אות פלורסצנטיות, הכוח הסלולר יכולים למפות על-ידי קרינה פלואורסצנטית הדמיה.
כדי להדגים את היישום של ITS, אנו משתמשים דגים keratocyte כאן, מודל תא בשימוש נרחב עבור תא העברה המחקר30,31,32, צ’ו-K1 תא, שורת התאים nonmotile נפוץ וכן NIH 3T3 פיברובלסט. Coimaging של אינטגרין המתח ותא מבנים גם מתנהל.
Protocol
Representative Results
Discussion
ITS היא ונגישות גבוהה טכניקה חזקה עבור הסלולר לאלץ את מיפוי במונחים של סינתזה והן ביישום. עם כל החומרים מוכנים, ITS יכול להיות מסונתז בתוך יום אחד. במהלך הניסויים, נחוצים רק שלושה צעדים של ציפוי פני השטח לפני ציפוי התא. לאחרונה, אנחנו מפושט ההליך ציפוי צעד אחד נוסף על-ידי קישור ישירות את ITS אלבו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן האתחול המסופקים על-ידי איווה סטייט ומאת הלאומית המכון כללי רפואי למדעים (R35GM128747).
Materials
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
Riferimenti
- Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
- Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
- Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
- Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
- Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
- Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
- Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
- Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
- Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
- Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
- Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
- Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).
- Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
- Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
- Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
- Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
- Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
- Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
- Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
- Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
- Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
- Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
- Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
- Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
- Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
- Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
- Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
- Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
- Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
- Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
- Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
- de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences – Series IV – Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
- Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).
