توفر هذه المقالة طرق مفصلة لتلفيق وتوصيف جهاز microfluidic التشغيل الهوائي لضغط الخلايا الغضروفية.
ومن المعروف أن المحفزات الميكانيكية لتعديل الوظائف البيولوجية للخلايا والأنسجة. وقد اقترحت الدراسات الحديثة أن الإجهاد الضاغط يغير بنية غضروف لوحة النمو والنتائج في تعديل النمو من عظام طويلة من الأطفال. لتحديد دور الإجهاد الضاغط في نمو العظام، أنشأنا جهاز microfluidic تعمل بواسطة الضغط الهوائي، لضغط ديناميكيا (أو ثابت) خلايا chondrocytes لوحة النمو جزءا لا يتجزأ من اسطوانات هيدروجيل الجينات. في هذه المقالة، ونحن نصف الطرق التفصيلية لتلفيق وتميز هذا الجهاز. مزايا بروتوكولنا هي: 1) خمسة أحجام مختلفة من الإجهاد الضغط يمكن أن تولد على خمسة تكرارات التقنية في منصة واحدة، 2) فمن السهل تصور مورفولوجيا الخلية عن طريق المجهر الضوء التقليدي، 3) يمكن عزل الخلايا بسرعة من الجهاز بعد الضغط لتسهيل الاختبارات المصب، و 4) يمكن تطبيق منصة لدراسة الميكانيكية من أي نوع الخلية التي يمكن أن تنمو في هيدروجيلس.
المنصات ذات الهندسة الدقيقة هي أدوات قيمة لدراسة البيولوجيا الجزيئية والخلوية ومستوى الأنسجة لأنها تمكن السيطرة الديناميكية على كل من البيئات الدقيقة الفيزيائية والكيميائية1،2،3 ،4،5،6،7،8. وهكذا، يمكن اختبار فرضيات متعددة في وقت واحد بطريقة تسيطر عليها بإحكام. في حالة نمو الغضروف لوحة، وهناك أدلة متزايدة على دور مهم من الإجهاد الضغط في تحوير نموالعظام من خلال العمل على نمو لوحة الغضروف9،10،11، 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21،22،23،24،25. ومع ذلك، فإن آلية عمل الإجهاد الضغطي – على وجه الخصوص، كيف يوجه الإجهاد تشكيل أعمدة الخلايا الغضروفية في لوحة النمو – غير مفهومة بشكل جيد.
والهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء جهاز ضغط chondrocyte microfluidic تعمل هوائيا26 لتوضيح آليات الميكانيكا في الخلايا الغضروفية لوحة النمو (الشكل 1أ-ج). يتكون الجهاز من جزأين: وحدة التشغيل الهوائية وبنية هلام الجينات. يتم تصنيع وحدة التشغيل الهوائية microfluidic باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) على أساس التصوير والطباعة الحجرية الناعمة. تحتوي هذه الوحدة على مجموعة 5 × 5 من بالونات غشاء PDMS رقيقة والتي يمكن تضخيمها بشكل مختلف على أساس أقطارها. يتكون بناء هلام الجينات من الخلايا الغضروفية المضمنة في مجموعة 5 × 5 من اسطوانات هلام الجينات، ويتم تجميع بنيات الجينات والخلايا الغضروفية بأكملها مع وحدة التدجين. يتم ضغط المنشآت هلام الجينات بواسطة بالونات PDMS تضخم هوائيا(الشكل 1b). الجهاز microfluidic يمكن أن تولد خمسة مستويات مختلفة من الإجهاد الضغط في وقت واحد في منصة واحدة على أساس الاختلافات في قطر بالون PDMS. وهكذا، من الممكن إجراء اختبار عالي الإنتاجية للميكنة في الخلايا الغضروفية في ظل ظروف ضغط متعددة.
الجهاز microfluidic الموصوفة في هذا البروتوكول لديها العديد من المزايا على جهاز الضغط التقليدية مثل المثبتات الخارجية14،21،23 وأجهزة الضغط العيانية16، 19 سنة , 27 , 28 لدراسة الميكانيكا chondrocyte: 1) الجهاز microfluidic فعالة من حيث التكلفة لأنه يستهلك حجم أصغر من العينات من جهاز ضغط العيان، 2) الجهاز microfluidic هو الوقت الفعال لأنه يمكن اختبار متعددة ظروف الضغط في وقت واحد، 3) الجهاز microfluidic يمكن الجمع بين المحفزات الميكانيكية والكيميائية عن طريق تشكيل تدرج تركيز المواد الكيميائية على أساس خلط محدود في القنوات الدقيقة، و 4) تقنيات الفحص المجهري المختلفة (الفاصل الزمني يمكن تطبيق الفحص المجهري والفلورة المجهرية البؤرية) مع الجهاز microfluidic مصنوعة من PDMS شفافة.
اعتمدنا وعدلنا طريقة Moraes وآخرون7،29 لخلق مستويات ضغط مختلفة في جهاز واحد لتمكين الدراسات الميكانيكية عالية الإنتاجية من ضغط الخلايا الغضروفية. نهجنا مناسب للخلايا (على سبيل المثال، chondrocytes) التي تحتاج إلى بيئة ثقافية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) وللاختبارات البيولوجية بعد ضغط الخلايا. على الرغم من أن بعض أجهزة ضغط الخلايا الدقيقة يمكن ضغط الخلايا المستزرعة على ثنائي الأبعاد (2D) ركائز30،31،32،لا يمكن استخدامها لchondrocytes لأن الخلايا الغضروفية المستزرعة 2D إزالة التمييز. هناك منصات microfluidic لضغط الخلايا المستزرعة 3D في هيدروجيلات ضوئية7،33، لكنها محدودة في عزل الخلايا بعد تجارب الضغط لأن عزل الخلايا من البلمرة الضوئية هيدروجيل ليس من السهل. وبالإضافة إلى ذلك، قد يلزم تقييم آثار التعرض للأشعة فوق البنفسجية وبادئات الربط بين الصور على الخلايا. وعلى النقيض من ذلك، تسمح طريقتنا بالعزل السريع للخلايا بعد تجارب الضغط لاختبارات ما بعد البيولوجيا لأن هيدروجيلات الجينات يمكن أن تكون منزوعة البوليمر بسرعة من قبل مخلب اتلاف الكالسيوم. ويرد في هذا البروتوكول وصف لأساليب تصنيع الأجهزة المفصلة وتوصيفها. يظهر في الشكل 2إجراء موجز لتلفيق جهاز ضغط الخلايا الغضروفية الدقيقة.
لاختبار آثار الإجهاد الضاغط على الخلايا الغضروفية لوحة النمو، قمنا بتطوير جهاز ضغط الخلايا الغضروفية الدقيقة(الشكل 1)لتطبيق مستويات مختلفة من الإجهاد الضاغط على الخلايا الغضروفية في سقالة هيدروجيل الجينات ل3D الثقافة بطرق الإنتاجية العالية. لمساعدة الباحثين الآخرين على …
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتورين كريستوفر مورايس وستيفن أ. مورين على دعمهما لتصميم الأجهزة وتصنيعها. وقد تم دعم هذه الدراسة بمنحة الهندسة الحيوية للصحة البشرية من جامعة نبراسكا لينكولن (UNL) والمركز الطبي لجامعة نبراسكا (UNMC)، ومنحة AR070242 من المعهد الوطني للصحة/نظام المعلومات الوطني. نشكر جانيس أ. تايلور وجيمس ر. تالاسكا من المرفق الأساسي للميكروسكوب المتقدم في المركز الطبي لجامعة نبراسكا على تقديم المساعدة في الفحص المجهري البؤري.
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |