動的圧縮で軟性細胞を刺激するマイクロ流体プラットフォーム
Summary
この記事では、軟骨細胞圧縮のための空気作動性マイクロ流体デバイスを製造し、特徴付けるための詳細な方法を提供します。
Abstract
機械的刺激は、細胞や組織の生物学的機能を調節することが知られている。最近の研究は、圧縮応力が成長プレート軟骨アーキテクチャを変更し、子供の長い骨の成長変調をもたらすことを示唆しています。骨の成長における圧縮応力の役割を決定するために、我々は、アルギン酸ヒドロゲルシリンダに埋め込まれた成長プレート軟骨細胞を動的(または静的に)圧縮するために、空気圧によって作動するマイクロ流体装置を作成した。この記事では、このデバイスを製造および特性認識するための詳細な方法について説明します。私たちのプロトコルの利点は:1)単一のプラットフォームで5つの技術的な反復で圧縮応力の5つの異なる大きさを生成することができ、2)従来の光顕微鏡を介して細胞形態を視覚化することが容易であり、3)細胞は迅速に単離することができます下流アッセイを容易にする圧縮後のデバイスから、および4)プラットフォームは、ヒドロゲルで成長することができる任意の細胞タイプのメカノバイオロジーを研究するために適用することができます。
Introduction
マイクロエンジニアリングされたプラットフォームは、物理的および化学的微小環境1、2、3の両方の動的制御を可能にするため、分子、細胞、組織レベルの生物学を研究するための貴重なツールです。,4,5,6,7,8.したがって、複数の仮説を厳密に制御された方法で同時にテストすることができる。成長板軟骨の場合、成長板軟骨9、10、11上の作用を通じて骨の成長を調節する上で圧縮応力の重要な役割の証拠が増加している。 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25.しかし、圧縮応力の作用機序(特に、ストレスが成長プレートにおける軟骨細胞柱の形成を導く方法)は、あまり理解されていない。
このプロトコルの目的は、成長プレート軟骨細胞におけるメカノバイオロジーのメカニズムを解明するために、空気作動性マイクロ流体軟骨細胞圧縮装置26を作成することである(図1a-c)。装置は2つの部分から成っている:空気作動の単位およびアルギネートのゲルの構造。マイクロ流体空気作動ユニットは、フォトおよびソフトリソグラフィに基づいてポリジメチルシロキサン(PDMS)を使用して製造されます。この単位は直径に基づいて異なって膨張させることができる薄いPDMSの膜気球の5 x 5配列を含んでいる。アルギン酸ゲル構造体は、5 x 5配列のアルギン酸ゲルシリンダに埋め込まれた軟骨細胞から構成され、アルギン酸軟骨細胞構造全体が作動ユニットで組み立てられる。アルジンゲル構造体は、空気圧膨張PDMSバルーンによって圧縮される(図1b)。マイクロ流体デバイスは、PDMSバルーン径の違いに基づいて、単一のプラットフォームで5つの異なるレベルの圧縮応力を同時に生成できます。したがって、複数の圧縮条件下で軟骨細胞メカノバイオロジーのハイスループット試験が可能である。
このプロトコルに記載されているマイクロ流体デバイスは、外部固定装置14、21、23およびマクロスコピック圧縮装置16などの従来の圧縮装置に対して多くの利点を有する。19歳,27歳,28軟骨細胞メカノバイオロジーを研究するための:1)マイクロ流体デバイスは、マクロスコッキング圧縮装置よりもサンプルの量が少ないため、費用対効果が高く、2)マイクロ流体装置は複数のテストが可能であるため、時間効果が高い圧縮条件同時に、3)マイクロ流体装置は、マイクロチャネル内の限られた混合に基づいて化学物質の濃度勾配を形成することにより、機械的および化学的刺激を組み合わせることができ、4)様々な顕微鏡検査技術(時間経過)顕微鏡と蛍光共焦点顕微鏡)は、透明なPDMSで作られたマイクロ流体デバイスで適用することができます。
Moraes et al.7,29の方法を採用し、単一のデバイスで異なる圧縮応力レベルを作成し、軟骨細胞圧縮のハイスループットメカノバイオロジー研究を可能にした。我々のアプローチは、3次元(3D)培養環境を必要とする細胞(例えば、軟ヶ月細胞)や細胞を圧縮した後の生物学的アッセイに適しています。一部のマイクロ流体細胞圧縮装置は、2次元(2D)基板30、31、32で培養した細胞を圧縮できるが、2D培養軟次郎であるため軟化細胞には使用できない。脱分化。光重合ヒドロゲル7、33の3D培養細胞を圧縮するためのマイクロ流体プラットフォームがありますが、光重合から細胞を分離するため、圧縮実験後の細胞の分離には限界があります。ヒドロゲルは容易ではありません。さらに、細胞に対する紫外線(UV)暴露および写真架橋イニシエータの影響を評価する必要があるかもしれません。対照的に、我々の方法は、アルギン酸ヒドロゲルがカルシウムキレート器によって迅速に脱重合することができるので、ポスト生物学的アッセイのための圧縮実験後の細胞の迅速な単離を可能にする。このプロトコルでは、詳細なデバイス製造および特性分類方法について説明します。マイクロ流体軟骨細胞圧縮装置を製造するための簡単な手順を図2に示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
成長プレート軟骨細胞に対する圧縮応力の影響をテストするために、3D用アルギン酸ヒドロゲル足場の軟骨細胞に様々なレベルの圧縮応力を適用するマイクロ流体軟骨細胞圧縮装置(図1)を開発した。高スループットの方法で文化。他の研究者が当社のデバイスを採用したり、同様のデバイスを開発したりするのを支援するために、このプロトコルの記事でデバイス製造?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
クリストファー・モラエス博士とスティーブン・A・モリン博士のデバイス設計と製作支援に感謝します。この研究は、ネブラスカ大学リンカーン校(UNL)とネブラスカ大学医療センター(UNMC)からのヒト健康補助金のバイオエンジニアリングと、NIH/NIAMSからAR070242を助成しました。私たちは、ネブラスカ大学医療センターの高度顕微鏡コア施設のジャニス・A・テイラーとジェームズ・R・タスカスに、共焦点顕微鏡検査の支援を提供してくれたことに感謝します。
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
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