Een Microfluïdisch platform voor het stimuleren van chondrocyten met dynamische compressie
Summary
Dit artikel biedt gedetailleerde methoden voor het vervaardigen en karakteriseren van een pneumatisch bedienend microfluïdisch apparaat voor chondrocyten compressie.
Abstract
Mechanische stimuli zijn bekend om het moduleren van biologische functies van cellen en weefsels. Recente studies hebben gesuggereerd dat compressieve stress verandert groei plaat kraakbeen architectuur en resulteert in groei modulatie van lange botten van kinderen. Om de rol van compressieve stress in botgroei te bepalen, hebben we een microfluïdisch apparaat gecreëerd dat door de pneumatische druk wordt bediend, om de groei plaat chondrocyten die in alginaat hydrogel cilinders zijn ingebed dynamisch (of statisch) te comprimeren. In dit artikel beschrijven we gedetailleerde methoden voor het fabriceren en karakteriseren van dit apparaat. De voordelen van ons protocol zijn: 1) vijf verschillende magnitudes van druk stress kunnen worden gegenereerd op vijf technische replicaten in een enkel platform, 2) het is gemakkelijk om celmorfologie te visualiseren via een conventionele lichtmicroscoop, 3) cellen kunnen snel worden geïsoleerd vanaf het apparaat na compressie om downstream testen te faciliteren, en 4) kan het platform worden toegepast om mechanobiologie te bestuderen van elk celtype dat in hydrogels kan groeien.
Introduction
Micro-engineered platforms zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van de moleculaire, cellulaire en weefselniveau biologie, omdat ze dynamische controle van zowel de fysieke en chemische micro-omgevingen1,2,3 ,4,5,6,7,8. Zo kunnen meerdere hypotheses tegelijkertijd op een strak gecontroleerde manier worden getest. In het geval van groei plaat kraakbeen, er zijn toenemende bewijzen van een belangrijke rol van compressieve stress bij het moduleren van botgroei door middel van actie op de groei plaat kraakbeen9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Echter, het werkingsmechanisme van compressieve stress – in het bijzonder, hoe stress leidt de vorming van chondrocyten kolommen in de groei plaat – is slecht begrepen.
Het doel van dit protocol is om een pneumatisch bedienend microfluïdisch chondrocyten compressie apparaat te creëren26 om mechanismen van mechanobiologie in de groei plaat chondrocyten te verhelderden (Figuur 1a-c). Het apparaat bestaat uit twee delen: de pneumatische bedieningseenheid en de alginaat gelconstructie. De microfluïdische pneumatische bedieningseenheid is vervaardigd met behulp van Polydimethylsiloxaan (PDM’S) op basis van de foto-en soft-lithografie. Deze unit bevat een 5 x 5 array van dunne PDMS membraan ballonnen die verschillend kunnen worden opgeblazen op basis van hun diameters. De alginaat gel construct bestaat uit de chondrocyten ingebed in een 5 x 5 array van alginaat gelcilinders, en de hele alginaat-Chondrocyte constructies worden geassembleerd met de bedieningseenheid. De alginaatgel constructies worden gecomprimeerd door de pneumatisch opgeblazen PDMS ballonnen (Figuur 1b). Het microfluïdische apparaat kan tegelijkertijd vijf verschillende niveaus van druk stress genereren in een enkel platform op basis van verschillen in de ballon diameter van de PDMS. Zo is een high-throughput test van chondrocyten mechanobiologie onder meerdere compressie omstandigheden mogelijk.
Het in dit protocol beschreven microfluïdische apparaat heeft veel voordelen ten opzichte van het conventionele compressie apparaat, zoals externe fixators14,21,23 en macroscopische compressie apparaten16, 19 , 27 , 28 voor het bestuderen van chondrocyten mechanobiologie: 1) het microfluïdische apparaat is kosteneffectief omdat het kleinere hoeveelheden monsters verbruikt dan het macroscopische compressie apparaat, 2) het microfluïdische apparaat is tijd effectief omdat het meerdere compressie condities gelijktijdig, 3) het microfluïdische apparaat kan mechanische en chemische stimuli combineren door een concentratie gradiënt van chemicaliën te vormen op basis van de beperkte menging in microkanalen, en 4) verschillende microscopie technieken (timelapse microscopie en fluorescentie confocale microscopie) kunnen worden toegepast met het microfluïdische apparaat gemaakt van transparante PDM’S.
We hebben de methode van Moraes et al.7,29 aangenomen en aangepast om verschillende druk stress niveaus te creëren in een enkel apparaat om high-throughput mechanobiologie studies van chondrocyten compressie mogelijk te maken. Onze aanpak is geschikt voor cellen (bijv. chondrocyten) die drie-dimensionale (3D) cultuur omgeving nodig hebben en voor biologische assays na het comprimeren van cellen. Hoewel sommige microfluïdische celcompressiestellen cellen kunnen comprimeren op tweedimensionale (2D) substraten30,31,32, kunnen ze niet worden gebruikt voor chondrocyten omdat 2D gekweekte chondrocyten dedifferentiëren. Er zijn microfluïdische platformen voor het comprimeren van 3D gekweekte cellen in photopolymerized hydrogels7,33, maar ze zijn beperkt in het isoleren van cellen na compressie experimenten omdat cellen isoleren van photopolymerized hydrogel is niet gemakkelijk. Bovendien moeten de effecten van ultraviolette (UV) belichting en foto crosslinking-initiators op cellen mogelijk worden geëvalueerd. In tegenstelling hiermee maakt onze methode het mogelijk snelle isolatie van cellen na compressie experimenten voor post biologische assays omdat alginaat hydrogels snel kunnen worden gedepolymeriseerd door calcium chelatoren. De gedetailleerde apparatuur fabricage en karakterisatie methoden worden beschreven in dit protocol. Een korte procedure voor het vervaardigen van de microfluïdische chondrocyten compressie-inrichting wordt weergegeven in Figuur 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om de effecten van druk stress op de groei plaat chondrocyten te testen, ontwikkelden we de microfluïdische chondrocyten compressie-inrichting (Figuur 1) om verschillende niveaus van druk stress toe te passen op de chondrocyten in de alginaat hydrogel steiger voor 3D cultuur in hoge doorvoer wegen. Om andere onderzoekers te helpen om ons apparaat aan te nemen of om soortgelijke apparaten te ontwikkelen, hebben we details gegeven van de stappen voor het fabricage apparaat in dit protocol art…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken drs. Christopher Moraes en Stephen A. Morin voor hun ondersteuning voor apparaatontwerp en fabricage. Deze studie werd ondersteund door Bioengineering for Human Health Grant van de University of Nebraska-Lincoln (UNL) en de University of Nebraska Medical Center (UNMC), en Grant AR070242 van de NIH/NIAMS. We danken Janice A. Taylor en James R. Talaska van de geavanceerde microscopie kern faciliteit aan de Universiteit van Nebraska Medical Center voor het verlenen van hulp met confocale microscopie.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
Riferimenti
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
- Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
- Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
- García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
- Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
- Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
- Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
- Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
- Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
- Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
- Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
- Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
- Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
- Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
- Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
- Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
- Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
- Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
- Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
- Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
- Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
- Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
- Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
- Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
- Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
- Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
- Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
- Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
