Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform
Summary
Bu makalede, kondrosit sıkıştırma için pnömatik olarak mikroakışkan bir cihaz imal etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı yöntemler sağlanmıştır.
Abstract
Mekanik uyaranların hücre ve dokuların biyolojik fonksiyonlarını modüle etmek için bilinmektedir. Son çalışmalar, kompresif stresin büyüme plakası kıkırdak mimarisini değiştirdiğini ve çocukların uzun kemiklerinin büyüme modülasyonuna neden olduğunu ileri sürmüştür. Kemik büyümesinde kompresif stresin rolünü belirlemek için, aljinat hidrojel silindirlerine gömülü büyüme plakası kondrositlerini dinamik (veya statik olarak) sıkıştırmak için pnömatik basınçla aktive edilmiş mikroakışkan bir cihaz oluşturduk. Bu makalede, bu aygıtın üretilmesi ve karakterizasyonu için ayrıntılı yöntemler açıklanmıştır. Protokolümüzün avantajları şunlardır: 1) Beş farklı basınç büyüklüğü tek bir platformda beş teknik kopyada oluşturulabilir, 2) Geleneksel ışık mikroskobu ile hücre morfolojisini görselleştirmek kolaydır, 3) Hücreler hızla izole edilebilir sıkıştırma sonrası cihazdan aşağı tahlilleri kolaylaştırmak için, ve 4) Platform hidrojellerde büyüyebilir herhangi bir hücre tipi nin mekanobiyoloji çalışma için uygulanabilir.
Introduction
Mikro-mühendislik platformları moleküler, hücresel ve doku düzeyi biyolojisini incelemek için değerli araçlardır çünkü hem fiziksel hem de kimyasal mikroortamların dinamik kontrolünü sağlarlar1,2,3 ,4,5,6,7,8. Böylece, birden fazla hipotez aynı anda sıkı bir şekilde test edilebilir. Büyüme plaka kıkırdağı durumunda, büyüme plaka kıkırdak9,10,11eylem yoluyla kemik büyümesi modüle kompresör stres önemli bir rol artan kanıtlar vardır, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Ancak, kompresif stres eylem mekanizması – özellikle, nasıl stres büyüme plaka kondrosit sütunoluşumunu yönlendirir – kötü anlaşılmaktadır.
Bu protokolün amacı, büyüme plakası kondrositlerde mekanobiyolojinin mekanizmalarını açıklamak için pnömatik olarak harekete geçirici mikroakışkan kondrosit kompresyon cihazı26 oluşturmaktır (Şekil 1a-c). Cihaz iki bölümden oluşur: pnömatik aktüasyon ünitesi ve aljinat jel yapı. Mikroakışkan pnömatik aktüasyon ünitesi foto- ve yumuşak litografiye dayalı polidimetilsiloksane (PDMS) kullanılarak imal edilmistir. Bu ünite, çaplarına göre farklı şekilde şişirilebilen 5 x 5 dizi ince PDMS membran balon içerir. Aljinat jel yapısı aljinat jel silindir5 x 5 dizi gömülü kondrositoluşur, ve tüm aljinat-kondrosit yapıları aktüasyon ünitesi ile monte edilir. Aljinat jel yapıları pnömatik şişirilmiş PDMS balonları tarafından sıkıştırılır(Şekil 1b). Mikroakışkan cihaz, PDMS balon çapındaki farklılıklara bağlı olarak tek bir platformda aynı anda beş farklı düzeyde sıkıştırma oluşturabilir. Böylece birden fazla sıkıştırma koşullarında kondrosit mekanobiyolojisinin yüksek iş gücü testi mümkündür.
Bu protokolde tanımlanan mikroakışkan cihaz, dış fiksatörler14, 21,23 ve makroskopik sıkıştırma cihazları16gibi konvansiyonel sıkıştırma cihazına göre birçok avantaja sahiptir. 19.09.20 , 27.000 , 28 kondrosit mekanobiyolojisi çalışmak için: 1) Mikroakışkan cihaz, makroskopik sıkıştırma cihazından daha az miktarda numune tükettiği için uygun maliyetlidir, 2) Mikroakışkan cihaz zaman etkilidir, çünkü birden fazla test edebilir sıkıştırma koşulları aynı anda, 3) Mikroakışkan cihaz, mikrokanallardaki sınırlı karıştırmaya dayalı kimyasalların konsantrasyon gradyanı oluşturarak mekanik ve kimyasal uyaranları birleştirebilir ve 4) Çeşitli mikroskopi teknikleri (zaman atlamalı mikroskopi ve floresan konfokal mikroskopi) şeffaf PDMS’den yapılmış mikroakışkan cihaz ile uygulanabilir.
Biz kabul ve kondrosit sıkıştırma yüksek iş letme mechanobiology çalışmaları sağlamak için tek bir cihazda farklı kompresif stres düzeyleri oluşturmak için Moraes ve ark.7,29 yöntemini değiştirdi. Yaklaşımımız, üç boyutlu (3D) kültür ortamına ihtiyaç duyan hücreler (örneğin kondrositler) ve hücreleri sıkıştırdıktan sonra biyolojik tahliller için uygundur. Bazı mikroakışkan hücre sıkıştırma cihazları iki boyutlu (2D) yüzeylerde kültürlenmiş hücreleri sıkıştırabilse de30,31,32, 2D kültürlü kondrositler için kullanılamazlar, çünkü 2D kültürlü kondrositler defarklılaştırma. Fotopolimerize hidrojeller7,333D kültürlü hücreleri sıkıştırmak için mikroakışkan platformlar vardır, ancak fotopolimerize hücreleri izole çünkü sıkıştırma deneyleri sonrası hücreleri izole sınırlıdır hydrogel kolay değildir. Ayrıca, ultraviyole (UV) maruz ilerlik ve fotoğraf crosslinking başlatıcılarının hücreler üzerindeki etkilerinin de değerlendirilmesi gerekebilir. Buna karşılık, aljinat hidrojeller kalsiyum şelatörler tarafından hızlı bir şekilde depolimerize edilebilir, çünkü bizim yöntem post biyolojik tahliller için sıkıştırma deneyleri sonra hücrelerin hızlı izolasyon sağlar. Ayrıntılı cihaz üretim ve karakterizasyon yöntemleri bu protokolde açıklanmıştır. Mikroakışkan kondrosit sıkıştırma cihazının imalatı için kısa bir prosedür Şekil 2’degösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kompresif stresin büyüme plakası kondrositleri üzerindeki etkilerini test etmek için, 3D için aljinat hidrojel iskelesindeki kondrositlere çeşitli kompresif stres düzeyleri uygulamak için mikroakışkan kondrosit sıkıştırma cihazını(Şekil 1)geliştirdik. yüksek iş verme yollarında kültür. Diğer araştırmacıların cihazıbenimsemelerine veya benzer cihazlar geliştirmelerine yardımcı olmak için, bu protokol makalesinde cihaz üretim adımlarının ayrıntılarını…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Christopher Moraes ve Stephen A. Morin’e cihaz tasarımı ve imalatına verdikleri destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Nebraska-Lincoln Üniversitesi (UNL) ve Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi’nden (UNMC) İnsan Sağlığı için Biyomühendislik bursu ile desteklenmiş ve NIH/NIAMS’tan AR070242 hibesi verilmiştir. Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi’ndeki İleri Mikroskopi Çekirdek Tesisi’nden Janice A. Taylor ve James R. Talaska’ya konfokal mikroskopi konusunda yardımcı olduklarından dolayı teşekkür ederiz.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
Riferimenti
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
- Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
- Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
- García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
- Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
- Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
- Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
- Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
- Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
- Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
- Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
- Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
- Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
- Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
- Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
- Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
- Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
- Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
- Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
- Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
- Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
- Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
- Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
- Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
- Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
- Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
- Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
- Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
