Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression
Summary
Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden zur Herstellung und Charakterisierung einer pneumatisch betätigten mikrofluidischen Vorrichtung für die Chondrozytenkompression.
Abstract
Mechanische Reize sind dafür bekannt, biologische Funktionen von Zellen und Geweben zu modulieren. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Druckstress die Knorpelarchitektur der Wachstumsplatte verändert und zu einer Wachstumsmodulation langer Knochen von Kindern führt. Um die Rolle der Druckspannung beim Knochenwachstum zu bestimmen, haben wir ein mikrofluidisches Gerät entwickelt, das durch pneumatischen Druck betätigt wird, um Wachstumsplattenchondrozyten, die in Alginat-Hydrogel-Zylinder eingebettet sind, dynamisch (oder statisch) zu komprimieren. In diesem Artikel beschreiben wir detaillierte Methoden zum Herstellung und Charakterisieren dieses Geräts. Die Vorteile unseres Protokolls sind: 1) Fünf verschiedene Größen von Druckspannung können auf fünf technischen Replikationen in einer einzigen Plattform erzeugt werden, 2) Es ist einfach, Zellmorphologie über ein herkömmliches Lichtmikroskop zu visualisieren, 3) Zellen können schnell isoliert werden vom Gerät nach der Kompression, um nachgeschaltete Assays zu erleichtern, und 4) Die Plattform kann angewendet werden, um Mechanobiologie jeder Zellart zu studieren, die in Hydrogelen wachsen kann.
Introduction
Mikroentwickelte Plattformen sind wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung der molekularen, zellulären und Gewebebiologie, da sie eine dynamische Steuerung sowohl der physikalischen als auch der chemischen Mikroumgebungen ermöglichen1,2,3 ,4,5,6,7,8. So können mehrere Hypothesen gleichzeitig streng kontrolliert getestet werden. Im Falle des Wachstumsplattenknorpels gibt es zunehmend Hinweise auf eine wichtige Rolle der Druckspannung bei der Modulation des Knochenwachstums durch Wirkung auf die Wachstumsplatte Knorpel9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Der Wirkmechanismus der Druckspannung – insbesondere, wie Stress die Bildung von Chondrozytensäulen in der Wachstumsplatte leitet – wird jedoch schlecht verstanden.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine pneumatisch betätigende mikrofluidische Chondrozytenkompressionsvorrichtung26 zu schaffen, um Mechanismen der Mechanobiologie in Wachstumsplattenchondrozyten aufzuklären (Abbildung 1a-c). Das Gerät besteht aus zwei Teilen: der pneumatischen Betätigungseinheit und dem Alginat-Gel-Konstrukt. Die mikrofluidische pneumatische Betätigungseinheit wird aus Polydimethylsiloxan (PDMS) auf Basis der Photo- und Softlithographie hergestellt. Diese Einheit enthält ein 5 x 5 Array von dünnen PDMS-Membranballons, die je nach Durchmesser unterschiedlich aufgeblasen werden können. Das Alginat-Gel-Konstrukt besteht aus den Chondrozyten, die in ein 5 x 5-Array von Alginat-Gel-Zylindern eingebettet sind, und die gesamten Alginat-Chondrozyten-Konstrukte werden mit der Betätigungseinheit zusammengesetzt. Die Alginat-Gel-Konstrukte werden durch die pneumatisch aufgeblasenen PDMS-Ballons komprimiert (Abbildung 1b). Das mikrofluidische Gerät kann auf der Grundlage von Unterschieden im PDMS-Ballondurchmesser fünf verschiedene Druckstufen gleichzeitig in einer einzigen Plattform erzeugen. Somit ist ein Hochdurchsatztest der Chondrozytenmechanobiologie unter mehrfachen Kompressionsbedingungen möglich.
Das in diesem Protokoll beschriebene mikrofluidische Gerät hat gegenüber dem herkömmlichen Kompressionsgerät viele Vorteile, wie z. B. externe Fixatoren14,21,23 und makroskopische Kompressionsgeräte16, 19 , 27 , 28 für das Studium der Chondrozyten-Mechanobiologie: 1) Das mikrofluidische Gerät ist kostengünstig, da es ein geringeres Volumen an Proben verbraucht als das makroskopische Kompressionsgerät, 2) Das mikrofluidische Gerät ist zeiteffektiv, da es mehrere Kompressionsbedingungen gleichzeitig, 3) Das mikrofluidische Gerät kann mechanische und chemische Reize kombinieren, indem es einen Konzentrationsgradienten von Chemikalien bildet, der auf der begrenzten Vermischung in Mikrokanälen basiert, und 4) Verschiedene Mikroskopietechniken (Zeitraffer Mikroskopie und Fluoreszenzkonfokalmikroskopie) kann mit dem mikrofluidischen Gerät aus transparentem PDMS aufgetragen werden.
Wir übernahmen und modifizierten die Methode von Moraes et al.7,29, um verschiedene Druckspannungsniveaus in einem einzigen Gerät zu schaffen, um hochdurchsatz-mechanobiologische Studien der Chondrozytenkompression zu ermöglichen. Unser Ansatz eignet sich für Zellen (z.B. Chondrozyten), die eine dreidimensionale (3D) Kulturumgebung benötigen, und für biologische Tests nach dem Komprimieren von Zellen. Obwohl einige mikrofluidische Zellkompressionsgeräte Zellen komprimieren können, die auf zweidimensionalen (2D) Substraten kultiviert sind30,31,32, können sie nicht für Chondrozyten verwendet werden, da 2D-kultivierte Chondrozyten dedifferenziert. Es gibt mikrofluidische Plattformen zum Komprimieren von 3D-kultivierten Zellen in photopolymerisierten Hydrogelen7,33, aber sie sind in der Isolierung von Zellen nach Kompressionsexperimenten begrenzt, da die Isolierung von Zellen von photopolymerisierten Hydrogel ist nicht einfach. Darüber hinaus müssen die Auswirkungen der UV-Exposition (UV) und der Photovernetzung von Initiatoren auf Zellen möglicherweise bewertet werden. Im Gegensatz dazu ermöglicht unsere Methode eine schnelle Isolierung von Zellen nach Kompressionsexperimenten für postbiologische Assays, da Alginathydrogele schnell durch Kalziumchelatoren depolymerisiert werden können. Die detaillierten Methoden zur Geräteherstellung und -charakterisierung werden in diesem Protokoll beschrieben. Abbildung 2zeigt ein kurzes Verfahren zur Herstellung des mikrofluidischen Chondrozyten-Kompressionsgeräts .
Protocol
Representative Results
Discussion
Um die Auswirkungen der Druckspannung auf Wachstumsplattenchondrozyten zu testen, haben wir das mikrofluidische Chondrozytenkompressionsgerät (Abbildung 1) entwickelt, um verschiedene Druckgrade auf die Chondrozyten im Alginat-Hydrogelgerüst für 3D anzuwenden. Kultur auf hochdurchsatzweise. Um andere Forscher bei der Einführung unseres Geräts oder der Entwicklung ähnlicher Geräte zu unterstützen, haben wir in diesem Protokollartikel Details zu den Schritte zur Geräteherstellung bere…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Drs. Christopher Moraes und Stephen A. Morin für ihre Unterstützung bei gerätedesign und -herstellung. Diese Studie wurde durch das Bioengineering for Human Health Stipendium der University of Nebraska-Lincoln (UNL) und des University of Nebraska Medical Center (UNMC) und das Stipendium AR070242 vom NIH/NIAMS unterstützt. Wir danken Janice A. Taylor und James R. Talaska von der Advanced Microscopy Core Facility am University of Nebraska Medical Center für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
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