Una piattaforma microfluidica per stimolare i condrociti con la compressione dinamica
Summary
Questo articolo fornisce metodi dettagliati per la fabbricazione e la caratterizzazione di un dispositivo microfluidico azionato retice per la compressione condrocitica.
Abstract
Gli stimoli meccanici sono noti per modulare le funzioni biologiche di cellule e tessuti. Recenti studi hanno suggerito che lo stress compressivo altera l’architettura della cartilagine della piastra di crescita e si traduce nella modulazione della crescita di ossa lunghe di bambini. Per determinare il ruolo dello stress compressivo nella crescita ossea, abbiamo creato un dispositivo microfluidico azionato dalla pressione pneumatica, per comprimere dinamicamente (o staticamente) i condrociti delle lame di crescita incorporati nei cilindri idrogelali algonati. In questo articolo vengono descritti i metodi dettagliati per la fabbricazione e la caratterizzazione di questo dispositivo. I vantaggi del nostro protocollo sono: 1) Cinque diverse magnitudini di stress compressivo possono essere generate su cinque repliche tecniche in un’unica piattaforma, 2) È facile visualizzare la morfologia cellulare tramite un microscopio luminoso convenzionale, 3) Le cellule possono essere rapidamente isolate dal dispositivo dopo la compressione per facilitare i saggi a valle, e 4) La piattaforma può essere applicata per studiare la meccanobiologia di qualsiasi tipo di cellula che può crescere in idrogel.
Introduction
Le piattaforme microingegnerizzate sono strumenti preziosi per studiare la biologia molecolare, cellulare e a livello tissutale perché consentono il controllo dinamico dei microambienti fisici e chimici1,2,3 ,4,5,6,7,8. Pertanto, più ipotesi possono essere testate contemporaneamente in modo strettamente controllato. Nel caso della cartilagine della piastra di crescita, ci sono sempre più prove di un ruolo importante di stress compressivo nella modulazione della crescita ossea attraverso l’azione sulla cartilagine della piastra di crescita9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Tuttavia, il meccanismo d’azione dello stress compressivo – in particolare, come lo stress guida la formazione di colonne condrociti nella piastra di crescita – è poco compreso.
L’obiettivo di questo protocollo è quello di creare un dispositivo di compressione condrocito microfluidico pneumaticamente azionante26 per chiarire i meccanismi di meccanobiologia nei condrociti della piastra di crescita (Figura 1a-c). Il dispositivo è costituito da due parti: l’unità di azionamento pneumatico e il costrutto gel algerato. L’unità di azionamento pneumatico microfluidico è fabbricata utilizzando polidimetilsiloxane (PDMS) basato sulla litografia foto e soft. Questa unità contiene una matrice 5 x 5 di sottili palloncini a membrana PDMS che possono essere gonfiati in modo diverso in base ai loro diametri. Il costrutto di gel alginato è costituito dai condrociti incorporati in una matrice 5 x 5 di cilindri di gel alginato, e tutti i costrutti algerino-condrocito sono assemblati con l’unità di azionamento. I costrutti di gel algerino sono compressi dai palloncini PDMS gonfiati pneumaticamente (Figura 1b). Il dispositivo microfluidico può generare contemporaneamente cinque diversi livelli di stress compressivo in un’unica piattaforma in base alle differenze nel diametro del palloncino PDMS. Pertanto, è possibile un test ad alto throughput di condrocite meccanobiologia in più condizioni di compressione.
Il dispositivo microfluidico descritto in questo protocollo ha molti vantaggi rispetto al dispositivo di compressione convenzionale come fissatori esterni14,21,23 e dispositivi di compressione macroscopica16, 19 del 12 , 27 mi lapiùdel , 28 per lo studio della condrocite meccanobiologia: 1) Il dispositivo microfluidico è conveniente perché consuma un volume di campioni inferiore rispetto al dispositivo di compressione macroscopica, 2) Il dispositivo microfluidico è efficace nel tempo perché può testare più condizioni di compressione simultanea, 3) Il dispositivo microfluidico può combinare stimoli meccanici e chimici formando un gradiente di concentrazione di sostanze chimiche basate sulla miscelazione limitata nei microcanali e 4) varie tecniche di microscopia (time-lapse microscopia e fluorescenza microscopia confocale) possono essere applicate con il dispositivo microfluidico in PDMS trasparente.
Abbiamo adottato e modificato il metodo di Moraes et al.7,29 per creare diversi livelli di stress compressivo in un unico dispositivo per consentire studi meccanobiologi ad alto throughput sulla compressione dei condrociti. Il nostro approccio è appropriato per le cellule (ad esempio, condrociti) che necessitano di ambiente di coltura tridimensionale (3D) e per i saggi biologici dopo la compressione delle cellule. Sebbene alcuni dispositivi di compressione delle cellule microfluidiche siano in grado di comprimere le cellule coltivate su substrati bidimensionali (2D)30,31,32, non possono essere utilizzati per i condrociti perché i condrociti coltivati in 2D disdifferenziare. Esistono piattaforme microfluidiche per la compressione di cellule coltivate 3D in idrogel fotopolimerizzati7,33, ma sono limitate nelle cellule di isolamento dopo esperimenti di compressione perché isolando le cellule da fotopolimerizzati idrogel non è facile. Inoltre, potrebbe essere necessario valutare gli effetti dell’esposizione agli ultravioletti (UV) e degli initatori foto-crosslinking sulle cellule. Al contrario, il nostro metodo consente un rapido isolamento delle cellule dopo esperimenti di compressione per saggi post-biologici perché gli idrogel alginati possono essere depolimerizzati rapidamente dai chelatori di calcio. I metodi dettagliati di fabbricazione e caratterizzazione del dispositivo sono descritti in questo protocollo. Nella figura 2è illustrata una breve procedura per la fabbricazione del dispositivo di compressione dei condrociti microfluidici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per testare gli effetti dello stress compressivo sui condrociti della piastra di crescita, abbiamo sviluppato il dispositivo di compressione condrociti microfluidico (Figura 1) per applicare vari livelli di stress compressivo ai condrociti nell’scaffold idrogel algerino per il 3D cultura in modo ad alta produttività. Per aiutare altri ricercatori ad adottare il nostro dispositivo o a sviluppare dispositivi simili, abbiamo fornito dettagli sulle fasi di fabbricazione del dispositivo in quest…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i dottori Christopher Moraes e Stephen A. Morin per il loro supporto per la progettazione e la fabbricazione dei dispositivi. Questo studio è stato sostenuto da Bioingegneria per la Salute Umana sovvenzione dall’Università del Nebraska-Lincoln (UNL) e l’Università del Nebraska Medical Center (UNMC), e concedere AR070242 dal NIH/ NIAMS. Ringraziamo Janice A. Taylor e James R. Talaska dell’Advanced Microscopy Core Facility presso l’University of Nebraska Medical Center per aver fornito assistenza con microscopia confocale.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
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