गतिशील संपीड़न के साथ Chondrocytes उत्तेजक के लिए एक Microfluidic मंच
Summary
यह लेख कोन्ड्रोसाइट संपीड़न के लिए एक वायवीय रूप से actuating microfluidic डिवाइस के निर्माण और विशेषता के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करता है।
Abstract
यांत्रिक उद्दीपक कोशिकाओं और ऊतकों के जैविक कार्यों को मॉडुलित करने के लिए जाना जाता है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि संपीड़न तनाव विकास प्लेट उपास्थि वास्तुकला को बदल देता है और बच्चों की लंबी हड्डियों के विकास मॉडुलन में परिणाम है। हड्डी के विकास में संपीड़न तनाव की भूमिका निर्धारित करने के लिए, हम एक microfluidic डिवाइस वायवीय दबाव द्वारा actuated बनाया, गतिशील रूप से (या स्थिर रूप से) सेक विकास प्लेट कोन्ड्रोसाइट्स alginate hydrogel सिलेंडरों में एम्बेडेड. इस आलेख में, हम इस डिवाइस को बनाने और विशेषता बनाने के लिए विस्तृत विधियों का वर्णन करते हैं. हमारे प्रोटोकॉल के फायदे हैं: 1) एक ही मंच में पांच तकनीकी प्रतिकृति पर संपीड़न तनाव के पांच अलग अलग परिमाण उत्पन्न किया जा सकता है, 2) यह एक पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोप के माध्यम से सेल आकृति विज्ञान कल्पना करने के लिए आसान है, 3) कोशिकाओं को तेजी से अलग किया जा सकता है संपीड़न के बाद डिवाइस से डाउनस्ट्रीम परख की सुविधा के लिए, और 4) मंच hydrogels में विकसित कर सकते हैं कि किसी भी सेल प्रकार के mechanobiology का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Introduction
सूक्ष्म इंजीनियर प्लेटफार्मों आणविक, सेलुलर, और ऊतक स्तर जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं क्योंकि वे दोनों भौतिक और रासायनिक microenvironments1,2,3 के गतिशील नियंत्रण सक्षम ,4,5,6,7,8. इस प्रकार, कई hypotheses एक साथ एक कसकर नियंत्रित तरीके से परीक्षण किया जा सकता है. विकास प्लेट उपास्थि के मामले में, वहाँ विकास प्लेट उपास्थि9,10,11पर कार्रवाई के माध्यम से हड्डी के विकास को मॉडुलन में संपीड़न तनाव की एक महत्वपूर्ण भूमिका के सबूत बढ़ रहे हैं, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. हालांकि, संपीड़न तनाव की कार्रवाई की क्रिया – विशेष रूप से, कैसे तनाव विकास प्लेट में कोन्ड्रोसाइट कॉलम के गठन गाइड – खराब समझा जाता है.
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक वायवीय रूप से संचालित माइक्रोप्रवाही कोन्ड्रोसाइट संपीड़न उपकरण26 को विकास प्लेट कोन्ड्रोसाइट्स में मेकोबायोलॉजी के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए बनाना है (चित्र 1ए-सी)। डिवाइस दो भागों के होते हैं: वायवीय actuation इकाई और alginate जेल का निर्माण. माइक्रोफ्लूइडिक वायवीय प्रवर्तक इकाई फोटो और मृदु-लिथोग्राफी के आधार पर पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) का उपयोग करके निर्मित है। इस इकाई पतली PDMS झिल्ली गुब्बारे जो अलग ढंग से उनके व्यास के आधार पर फुलाया जा सकता है की एक 5 x 5 सरणी शामिल हैं. ऐल्जिनेट जेल निर्माण में एल्जिनेट जेल सिलेंडरों की 5 x 5 सरणी में एम्बेडेड कोन्ड्रोसाइट्स होते हैं, और पूरे एल्गिनेट-कोन्ड्रोसाइट निर्माण actuation इकाई के साथ इकट्ठे होते हैं। ऐल्जिनेट जेल निर्माण वायवीय रूप से फुलाया PDMS गुब्बारे द्वारा संकुचित कर रहे हैं (चित्र 1b). microfluidic डिवाइस PDMS गुब्बारा व्यास में मतभेद के आधार पर एक ही मंच में एक साथ संपीड़न तनाव के पांच विभिन्न स्तरों उत्पन्न कर सकते हैं. इस प्रकार, कई संपीड़न स्थितियों के तहत कोन्ड्रोसाइट मेकोनोबायोलॉजी का एक उच्च-थ्रूपुट परीक्षण संभव है।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित microfluidic डिवाइस इस तरह के बाहरी fixators 14 ,21,23 और स्थूल संपीड़न उपकरणों16के रूप में पारंपरिक संपीड़न डिवाइस पर कई फायदे हैं, 19 , 27 , 28 कोन्ड्रोसाइट मेकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए: 1) माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस लागत प्रभावी है क्योंकि यह स्थूल संपीड़न डिवाइस की तुलना में नमूनों की छोटी मात्रा की खपत करता है, 2) माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस समय प्रभावी है क्योंकि यह कई परीक्षण कर सकता है संपीड़न शर्तों एक साथ, 3) microfluidic डिवाइस microchannels में सीमित मिश्रण के आधार पर रसायनों की एकाग्रता ढाल बनाने के द्वारा यांत्रिक और रासायनिक उत्तेजनाओं गठबंधन कर सकते हैं, और 4) विभिन्न माइक्रोस्कोपी तकनीक (समय चूक माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट कोनफोकल माइक्रोस्कोपी) को पारदर्शी पीडीएमएस से बने माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के साथ लागू किया जा सकता है।
हमने एक ही उपकरण में विभिन्न संपीडक तनाव के स्तर को बनाने के लिए मोरेस एट अल.7,29 की विधि को अपनाया और संशोधित किया ताकि कोन्ड्रोसाइट संपीड़न के उच्च-थ्रूपुट मेकोबायोलॉजी अध्ययन को सक्षम किया जा सके। हमारा दृष्टिकोण कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है (उदाहरण के लिए, chondrocytes) जो तीन आयामी (3 डी) संस्कृति पर्यावरण की जरूरत है और कोशिकाओं को संपीड़ित करने के बाद जैविक assays के लिए. हालांकि कुछ microfluidic सेल संपीड़न उपकरणों दो आयामी (2 डी) substrates30,31,32पर सुसंस्कृत कोशिकाओं को संपीड़ित कर सकते हैं , वे कोन्ड्रोसाइट्स के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है क्योंकि 2 डी सुसंस्कृत कोन्ड्रोसाइट्स अलग करना। वहाँ photopolymerized hydrogels 7 ,33में 3डी सुसंस्कृत कोशिकाओं को संपीड़ित करने के लिए microfluidic प्लेटफार्मों रहेहैं,लेकिन वे संपीड़न प्रयोगों के बाद कोशिकाओं को अलग करने में सीमित हैं क्योंकि photopolymerized से कोशिकाओं को अलग हाइड्रोजेल आसान नहीं है। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं पर पराबैंगनी (यूवी) जोखिम और फोटो क्रॉसलिंकिंग आरंभककर्ताओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके विपरीत, हमारी विधि पोस्ट जैविक परख के लिए संपीड़न प्रयोगों के बाद कोशिकाओं के तेजी से अलगाव की अनुमति देता है क्योंकि alginate hydrogels कैल्शियम chelators द्वारा जल्दी depolymerized किया जा सकता है. विस्तृत डिवाइस निर्माण और विशेषता विधियों इस प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. माइक्रोफ्लुइडिक कोन्ड्रोसाइट संपीडन युक्ति के निर्माण के लिए एक संक्षिप्त प्रक्रिया चित्र 2 में दर्शायागया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विकास प्लेट कोन्ड्रोसाइट्स पर संपीड़न तनाव के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, हमने 3 डी के लिए एल्जिनेट हाइड्रोजेल पाड़ में कोन्ड्रोसाइट्स में कोन्ड्रोसाइट्स के लिए संपीड़न तनाव के विभिन्न स्तरों को ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डिवाइस डिजाइन और निर्माण के लिए उनके समर्थन के लिए Drs. क्रिस्टोफर Moraes और स्टीफन ए मोरिन धन्यवाद. इस अध्ययन नेब्रास्का-Lincoln विश्वविद्यालय (यूएनएल) और नेब्रास्का मेडिकल सेंटर (UNMC) के विश्वविद्यालय से मानव स्वास्थ्य अनुदान के लिए Bioengineering द्वारा समर्थित किया गया था, और NIH से AR070242 अनुदान / हम Confocal माइक्रोस्कोपी के साथ सहायता प्रदान करने के लिए नेब्रास्का मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय में उन्नत माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा के जेनिस ए टेलर और जेम्स आर Talaska धन्यवाद.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
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