В этой статье приводятся подробные методы изготовления и характеристики пневматически актуального микрофлюидного устройства для сжатия хондроцитов.
Механические стимулы, как известно, модулировать биологические функции клеток и тканей. Недавние исследования показали, что сжатие стресса изменяет архитектуру пластины роста и приводит к модуляции роста длинных костей детей. Чтобы определить роль сжатия в росте костей, мы создали микрофлюидное устройство, действие которого сопровождается пневматическим давлением, чтобы динамически (или статически) сжать рост плиты хондроциты, встроенные в альгинатные гидрогелевые цилиндры. В этой статье мы описываем подробные методы изготовления и характеристики этого устройства. Преимущества нашего протокола: 1) Пять различных величин сжатия стресса могут быть созданы на пяти технических репликатов в одной платформе, 2) Легко визуализировать морфологию клеток с помощью обычного светового микроскопа, 3) Клетки могут быть быстро изолированы от устройства после сжатия для облегчения вниз по течению анализы, и 4) Платформа может быть применена для изучения механобиологии любого типа клеток, которые могут расти в гидрогелях.
Микро-инженерные платформы являются ценными инструментами для изучения молекулярной, клеточной и тканевой биологии уровня, поскольку они позволяют динамический контроль как физической и химической микросреды1,2,3 ,4,5,6,7,8. Таким образом, несколько гипотез могут быть одновременно проверены в строго контролируемой манере. В случае роста пластины хряща, Есть все больше доказательств важной роли сжатия стресса в модуляции роста костей через действие на рост пластины хряща9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Однако механизм действия сжимаемого стресса – в частности, как стресс направляет образование хондроцитов в ростовой пластине – плохо понятен.
Целью этого протокола является создание пневматически актуирующего микрофлюидного хондроцитного компрессионного устройства26 для выяснения механизмов механобиологии в хондроцитах пластины роста(рисунок 1a-c). Устройство состоит из двух частей: пневматического актуационного блока и конструкции альгината геля. Микрофлюидный пневматический актуационный блок изготавливается с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) на основе фото- и мягкой литографии. Это устройство содержит 5 х 5 массив тонких PDMS мембранных шаров, которые могут быть завышены по-разному в зависимости от их диаметров. Конструкция гель-альгината состоит из хондроцитов, встроенных в массив альгината гель 5, а все конструкции альгината-хондроцитов собраны с помощью актуационного блока. Конструкции гель альгината сжаты пневматически надутыми воздушными шарами PDMS(рисунок 1b). Микрофлюидическое устройство может генерировать пять различных уровней сжатия одновременно в одной платформе на основе различий в диаметре шарика PDMS. Таким образом, возможно высокое пропускное тестирование хондроцитной механобиологии при множественных условиях сжатия.
Микрофлюидическое устройство, описанное в этом протоколе, имеет много преимуществ перед обычным истрижным устройством сжатия, таким как внешние фиксаторы14,21,23 и макроскопические устройства сжатия16, 19 лет , 27 , 28 для изучения хондроцитов механобиологии: 1) Микрофлюидическое устройство является экономически эффективным, поскольку оно потребляет меньший объем образцов, чем макроскопическое устройство сжатия, 2) Микрофлюидическое устройство является эффективным временем, потому что он может проверить несколько условия сжатия одновременно, 3) Микрофлюидическое устройство может комбинировать механические и химические стимулы, образуя градиент концентрации химических веществ на основе ограниченного смешивания в микроканалах, и 4) Различные методы микроскопии (временной промежуток микроскопии и флуоресценции конфокальной микроскопии) могут быть применены с микрофлюидным устройством из прозрачного PDMS.
Мы приняли и модифицировали метод Moraes et al.7,29 для создания различных уровней сжатия в одном устройстве, чтобы обеспечить высокопроизводительные исследования механобиологии сжатия хондроцитов. Наш подход подходит для клеток (например, хондроцитов), которым необходима трехмерная (3D) культурная среда и для биологических анализов после сжатия клеток. Хотя некоторые микрофлюидные устройства сжатия клеток могут сжимать клетки, культивированные на двухмерных (2D) субстратах30,31,32, они не могут быть использованы для хондроцитов, потому что 2D культивированные хондроциты dedifferentiate. Существуют микрофлюидные платформы для сжатия 3D-культурных клеток в фотополимеризованных гидрогелях7,33,но они ограничены в изоляции клеток после экспериментов по сжатию, потому что изолирующие клетки от фотополимеризованных гидрогель не легко. Кроме того, влияние ультрафиолетового (УФ) воздействия и фото перекрестных инициаторов на клетки, возможно, потребуется оценить. В отличие от этого, наш метод позволяет быструю изоляцию клеток после экспериментов по сжатию для постбиологических анализов, потому что альгинатные гидрогели могут быть быстро деполимеризированы хеляторами кальция. Подробные методы изготовления и характеристики устройства описаны в этом протоколе. Краткая процедура изготовления микрофлюидного устройства сжатия хондроцитов показана на рисунке 2.
Чтобы проверить влияние сжатия на хондроциты пластины роста, мы разработали микрофлюидный хондроцитов компрессионного устройства (Рисунок 1) применять различные уровни сжатия стресса хондроцитов в альгината гидрогель эшафот для 3D культуры высокой пропускной всей Что…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим докторов Кристофера Мораеса и Стивена А. Морина за их поддержку в разработке и изготовлении устройств. Это исследование было поддержано биоинженерии для здоровья человека грант из Университета штата Небраска-Линкольн (UNL) и Университета штата Небраска медицинский центр (UNMC), и грант AR070242 от NIH / NIAMS. Мы благодарим Дженис А. Тейлор и Джеймса Р. Таласу (Janice A. Taylor) и Джеймса Р. Таласу (Janice A. Taylor) из Фонда расширенной микроскопии медицинского центра Университета штата Небраска за помощь в предоставлении помощи в обеспечении конфокальной микроскопии.
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |