זיהוי מוטציות על ידי ברזולוציה גבוהה התכה באוכלוסיית לעיבוד לקרקע של אורז
Summary
במאמר זה, אנו מציגים את הפרוטוקול המתואר כניתוח ההיתוך ברזולוציה גבוהה (HRM)-היעד מבוסס המושרה נגעים מקומיים Genomes (לעיבוד קרקע). שיטה זו משתמשת שינויים פלואורסצנטית במהלך ההיתוך של דופלקס ה-DNA והוא מתאים הקרנת תפוקה גבוהה של הן הכניסה/מחיקה (Indel) ו-substition בסיס יחיד (SBS).
Abstract
היעד המושרה נגעים מקומיים Genomes (לעיבוד קרקע) היא אסטרטגיה של גנטיקה הפוכה עבור הקרנת תפוקה גבוהה של מוטציות המושרה. עם זאת, למערכת לעיבוד קרקע יש פחות ישימות לצורך הכנסה/מחיקה (indel) ולעיבוד קרקע מסורתי צריך שלבים מורכבים יותר, כמו העיכול של CEL I נוקלאז ואלקטרופורזה ג’ל. כדי לשפר את יעילות התפוקה והבחירה, וכיצד להפוך את ההקרנה של שני האינדידלים והבסיס היחיד (SBSs) אפשרי, מערכת לעיבוד קרקע מבוססת (HRM) חדשה ברזולוציה גבוהה מפותחת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט HRM-לעיבוד קרקע ולהראות יישום שלה בהקרנה מוטציה. שיטה זו יכולה לנתח את המוטציות של ה-PCR הגברה על ידי מדידת הדנטורציה של דנ א כפול שנתקע בטמפרטורות גבוהות. ניתוח HRM מבוצע ישירות פוסט-PCR ללא עיבוד נוסף. יתר על כן, פשוטה, בטוחה ומהירה (SSF) שיטת הפקת DNA משולב עם HRM-לעיבוד לקרקע כדי לזהות הן Indels ו-SBSs. הפשטות שלה, חוסן ותפוקה גבוהה להפוך אותו שימושי לסריקת מוטציה אורז וגידולים אחרים.
Introduction
מוטציות הן משאבים גנטיים חשובים עבור צמח גנומיקה פונקציונלית מחקר ורבייה של זנים חדשים. הגישה הגנטית הקדמי (כלומר מתוך בחירת מוטציה לשכפול גנים או מגוון התפתחות) היתה השיטה העיקרית והבלעדית לשימוש של מוטציות המושרה על 20 שנה לפני. הפיתוח של שיטת גנטיקה הפוכה הרומן, לעיבוד קרקע (כיעד המושרה נגעים מקומיים Genomes) על ידי McCallum ואח ‘1 פתחה פרדיגמה חדשה והיא הוחלה מאז מספר רב של בעלי חיים ומינים צמח2. לעיבוד קרקע הוא שימושי במיוחד עבור תכונות רבייה כי הם מבחינה טכנית קשה או יקר להיקבע (למשל, עמידות למחלות, תוכן מינרלי).
לעיבוד הקרקע פותחה בתחילה עבור מוטציות פוינט הנגרמת על ידי מוטגנים כימיים (למשל, EMS1,3). הוא כולל את השלבים הבאים: הקמת אוכלוסיית לעיבוד קרקע (ים); ה-DNA הכנה ואיגוד של צמחים בודדים; הגברה של מקטע הדנ א של המטרה הטרודופלקסים היווצרות על ידי דנטורציה וריפוי של הגברה ומחשוף של ה-PCR באמצעות CEL I nuclease; ועל הנגעים המולקולריים. הספציפיים שלהם3,4 עם זאת, שיטה זו עדיין מורכבת יחסית, גוזלת זמן ותפוקה נמוכה. כדי להפוך אותה ליעילה יותר ובעלת תפוקה גבוהה יותר, פותחו שיטות רבות לעיבוד קרקע, כגון מחיקה לעיבוד קרקע (לפני הקרקע) (טבלה 1)1,3,5,6, . שבע,שמונה,תשע,10,11,12
הניתוח HRM עיקול, אשר מבוסס על שינויי הזריחה במהלך המסת ה-DNA דופלקס, הוא פשוט, חסכוני, והתפוקה גבוהה שיטה להקרנה מוטציה ו-הקלדה13. HRM כבר נעשה שימוש נרחב במחקר הצמח כולל מבוסס HRM לעיבוד קרקע (HRM-לעיבוד קרקע) עבור סינון מוטציות SBS הנגרמת על ידי EMS מוטגנזה14. כאן, הצגנו פרוטוקולים מפורטים HRM-לעיבוד קרקע להקרנה של מוטציות (הן Indel ו-SBS) הנגרמת על ידי גמא (γ) קרני אורז.
Protocol
Representative Results
Discussion
לעיבוד קרקע הוכיחה להיות כלי גנטי עוצמה הפוכה לזיהוי מוטציות המושרה עבור ניתוח פונקציונלי גנטי הרבייה יבול. עבור תכונות מסוימות לא בקלות נצפתה או נחוש, לעיבוד קרקע עם זיהוי מוטציה בתפוקה גבוהה PCR המבוסס יכול להיות שיטה שימושית כדי להשיג מוטציות עבור גנים שונים. שיטת “HRM-לעיבוד קרקע” שימש בא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (No 2016YFD0102103) והקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. 31701394).
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
