Identificando mutações por derretimento de alta resolução em uma população de lavando de arroz
Summary
Neste artigo, nós apresentamos o protocolo que é descrito como a análise de derretimento de alta resolução (HRM)-baseou as lesões locais induzidas alvo nos genomes (TILLING). Este método utiliza mudanças da fluorescência durante o derretimento do duplex do ADN e é apropriado para a seleção da elevado-produção da inserção/apagamento (Indel) e da única base cifras (SBS).
Abstract
As lesões locais induzidas alvo em genomes (TILLING) são uma estratégia da genética reversa para a seleção da elevado-produção de mutações induzidas. Entretanto, o sistema de TILLING tem menos aplicabilidade para a deteção da inserção/apagamento (Indel) e o TILLING tradicional precisa etapas mais complexas, como a digestão do nuclease do CEL I e a electroforese do gel. Para melhorar a eficiência da produção e da seleção, e para fazer a seleção dos indels e das Substitions de base únicas (SBSs) possíveis, um derretimento High-Resolution novo (HRM)-baseou o sistema de LAVRAMENTO é desenvolvido. Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado de HRM-TILLING e mostramos sua aplicação na seleção da mutação. Este método pode analisar as mutações de amplicões do PCR medindo a desnaturação do ADN dobro-encalhado em altas temperaturas. A análise de HRM é executada diretamente borne-PCR sem processamento adicional. Além disso, um método simples, seguro e rápido da extração do ADN (SSF) é integrado com HRM-TILLING para identificar indels e SBSs. Sua simplicidade, robustez e alta taxa de transferência torná-lo potencialmente útil para a mutação de digitalização em arroz e outras culturas.
Introduction
Mutantes são importantes recursos genéticos para a pesquisa de genômica funcional de plantas e criação de novas variedades. Uma aproximação da genética para diante (isto é. da seleção do mutante ao clonagem do gene ou ao desenvolvimento da variedade) usou-se para ser o método principal e único para o uso de mutações induzidas aproximadamente 20 anos há. O desenvolvimento de um novo método de genética reversa, o TILLING (direcionamento de lesões locais induzidas em genomas) por McCallum et al.1 , abriu uma nova paradigma e desde então tem sido aplicado em um grande número de espécies de animais e plantas2. O TILLING é particularmente útil para as características de reprodução que são tecnicamente difíceis ou dispendiosas de serem determinadas (por exemplo, resistência a doenças, conteúdo mineral).
A lavagens foi inicialmente desenvolvida para as mutações do ponto de triagem induzidas por mutagénicos químicos (por exemplo, EMS1,3). Inclui as seguintes etapas: o estabelecimento de uma população (s) de TILLING; Preparação de DNA e agrupamento de plantas individuais; Amplificação do PCR do fragmento do ADN do alvo; formação de heteroduplexes por desnaturação e recozimento de amplicões e clivagem de PCR por nuclease de cel I; e identificação de indivíduos mutantes e suas lesões moleculares específicas3,4. No entanto, esse método ainda é relativamente complexo, demorado e de baixa taxa de transferência. Para torná-lo mais eficiente e com maior produtividade, muitos métodos de lavo modificados foram desenvolvidos, como o apagamento da lavagem (de-lavagem) (tabela 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
A análise da curva de HRM, que é baseada em mudanças da fluorescência durante o derretimento do duplex do ADN, é um método simples, cost-effective, e high-throughput para a seleção da mutação e genotipagem13. A HRM já foi amplamente utilizada na pesquisa vegetal, incluindo o TILLING baseado em HRM (HRM-TILLING) para a triagem das mutações do SBS induzidas pela mutagenese do EMS14. Aqui, nós apresentamos protocolos detalhados de HRM-TILLING para a seleção das mutações (Indel e SBS) induzidas por raios da gama (γ) no arroz.
Protocol
Representative Results
Discussion
O TILLING provou ser uma poderosa ferramenta genética reversa para identificar mutações induzidas para a análise funcional do gene e a criação de culturas. Para algumas características que não são facilmente observadas ou determinadas, a TILLING com detecção de mutação baseada em PCR de alta taxa de transferência pode ser um método útil para obter mutantes para diferentes genes. O método HRM-TILLING tem sido utilizado em populações EMS-mutagenizadas de tomate12, trigo<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo programa-chave nacional de pesquisa e desenvolvimento da China (no. 2016YFD0102103) e pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (no. 31701394).
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
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