Выявление мутаций путем таяния высокого разрешения в TILLING населения риса
Summary
В этой статье мы представляем протокол, который описывается как анализ плавления с высоким разрешением (HRM) на основе целевых индуцированных локальных поражений в геномах (TILLING). Этот метод использует изменения флуоресценции во время плавления дуплекса ДНК и подходит для высокой пропускной связи скрининга как вставки / удаления (Indel) и одной базы субстанции (SBS).
Abstract
Целевая индуцированная локальная поражения в геномах (TILLING) является стратегией обратной генетики для высокой пропускной проверки индуцированных мутаций. Тем не менее, система TILLING имеет меньшую применимость для обнаружения вставки/удаления (Indel) и традиционные TILLING нуждается в более сложных шагах, таких как самоанализ пищеварения CEL I и электрофорез геля. Для повышения эффективности пропускной способностью и отбора, а также для того, чтобы сделать возможным скрининг как Indels, так и отдельных базовых субстанций (SBSs), разработана новая система плавления с высоким разрешением (HRM) tillING. Здесь мы представляем подробный протокол HRM-TILLING и показываем его применение при скрининге мутаций. Этот метод может анализировать мутации ампулконов ПЦР путем измерения денатурации двухцепочечной ДНК при высоких температурах. Анализ HRM непосредственно выполняется после ПЦР без дополнительной обработки. Кроме того, простой, безопасный и быстрый (SSF) метод извлечения ДНК интегрирован с HRM-TILLING для идентификации как Indels, так и SBS. Его простота, надежность и высокая пропускная готовность делают его потенциально полезным для сканирования мутаций в рисе и других культурах.
Introduction
Мутанты являются важными генетическими ресурсами для исследования функциональной геномики растений и разведения новых сортов. Передовой подход к генетике (т.е. от выбора мутантов до клонирования генов или развития разнообразия) был основным и единственным методом использования индуцированных мутаций около 20 лет назад. Разработка нового метода обратной генетики, TILLING (Нацеливание индуцированных местных поражений в геномах) McCallum et al.1 открыл новую парадигму, и с тех пор она была применена в большом количестве животных и растений видов2. TILLING особенно полезен для размножения, которые технически трудно или дорого определить (например, устойчивость к болезням, содержание минералов).
TILLING был первоначально разработан для мутаций точек скрининга, индуцированныххимическими мутагенами (например, EMS 1,3). Она включает в себя следующие шаги: создание TILLING населения (ы); подготовка ДНК и объединение отдельных растений; ПЦР усиление фрагмента ДНК-мишени; формации гетеродплексов путем денатурации и аннулирования ампулктонов ПЦР и расщепления с помощью cel I nuclease; и идентификация мутантов и ихспецифических молекулярных поражений 3,4. Тем не менее, этот метод по-прежнему является относительно сложным, отнимает много времени и низкой пропускной их. Чтобы сделать его более эффективным и с более высокой пропускной их, многие модифицированные методы TILLING были разработаны, такие как удаление TILLING (De-TILLING) (Таблица 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
Анализ кривой HRM, который основан на изменениях флуоресценции во время плавления дуплекса ДНК, является простым, экономичным и высокопроизводительным методом для скрининга мутаций и генотипирования13. HRM уже широко используется в исследованиях растений, включая HRM на основе TILLING (HRM-TILLING) для скрининга мутаций SBS, индуцированных EMS mutagenesis14. Здесь мы представили подробные протоколы HRM-TILLING для скрининга мутаций (как Indel, так и SBS), индуцированных гамма-лучами в рисе.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING оказался мощным обратным генетическим инструментом для выявления индуцированных мутаций для функционального анализа генов и разведения сельскохозяйственных культур. Для некоторых черт, которые не легко наблюдать или определить, TILLING с высокой пропускной памятью ПЦР на основе му…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальной программой исследований и разработок Китая (No 2016YFD0102103) и Национальным фондом естественных наук Китая (No31701394).
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
