쌀의 경작 인구에서 고분해능 용융에 의한 돌연변이 식별
Summary
이 문서에서는, 우리는 고분해능 용융 분석 (HRM) 기지를 둔 표적 유도한 게놈에 있는 국소 병변으로 기술되는 프로토콜을 제시합니다 (TILLING). 이 방법은 DNA 이중의 용융 동안 형광 변화를 이용하고 삽입 / 삭제 (Indel) 및 단일 염기 서브 스티션 (SBS)의 높은 처리량 스크리닝에 적합합니다.
Abstract
게놈에서 표적 유도국부 병변 (TILLING)은 유도된 돌연변이의 높은 처리량 스크리닝을 위한 역유전학의 전략이다. 그러나 TILLING 시스템은 삽입/삭제(Indel) 검출에 대한 적용가능성이 적으며, 전통적인 틸링은 CEL I 뉴클레아제 소화 및 겔 전기 영동과 같은 보다 복잡한 단계를 필요로 합니다. 처리량 및 선택 효율을 개선하고 인델 및 단일 베이스 대체(SBS)의 스크리닝을 가능하게 하기 위해 새로운 고해상도 용융(HRM) 기반 틸링 시스템이 개발되었습니다. 여기에서, 우리는 상세한 HRM-TILLING 프로토콜을 제시하고 돌연변이 검열에 있는 그것의 응용을 보여줍니다. 이 방법은 고온에서 이중 가닥 DNA의 변이를 측정하여 PCR 앰플리컨의 돌연변이를 분석할 수 있습니다. HRM 분석은 추가 처리 없이 PCR 후 직접 수행됩니다. 또한 간단하고 안전하며 빠른 (SSF) DNA 추출 방법은 HRM-TILLING과 통합되어 인델과 SBS를 모두 식별합니다. 단순성, 견고성 및 높은 처리량은 쌀 및 기타 작물의 돌연변이 스캐닝에 잠재적으로 유용합니다.
Introduction
돌연변이는 식물 기능 유전체학 연구 및 새로운 품종의 번식을위한 중요한 유전 자원이다. 전방 유전학 접근법(즉, 돌연변이 선택에서 유전자 복제 또는 다양한 발달에 이르기까지)은 약 20년 전에 유도된 돌연변이의 사용을 위한 주요 및 유일한 방법이었다. 새로운 역유전학 방법의 개발, TILLING (게놈에서 유도 된 국소 병변 을 표적으로) McCallum et al. 1은 새로운 패러다임을 열었고 이후 많은 수의 동물 및 식물 종2에적용되었습니다. TILLING은 기술적으로 어렵거나 비용이 많이 드는 특성(예: 질병 저항성, 미네랄 함량)을 사육하는 데 특히 유용합니다.
틸링은 처음에 화학적 돌연변이원(예를 들어, EMS1,3)에의해 유도된 스크리닝 포인트 돌연변이를 위해 개발되었다. 여기에는 다음 단계가 포함됩니다. DNA 준비 및 개별 식물의 풀링; 표적 DNA 단편의 PCR 증폭; CEL I 뉴클레아제에 의한 PCR 앰플리톤 및 절단의 변성 및 어닐링에 의한 이혈형성; 돌연변이 개인및 그들의 특정 분자 병변의 확인3,4. 그러나 이 방법은 여전히 비교적 복잡하고 시간이 오래 걸리며 처리량이 낮습니다. 더 효율적이고 높은 처리량으로, 삭제 틸링 (De-TILLING)(표1)1,3,5,6,등 많은 수정 된 틸링 방법이 개발되었습니다. 7,8,9,10,11,12.
DNA 이중의 용융 동안형광 변화에 기초한 HRM 곡선 분석은, 돌연변이 스크리닝 및 유전형 분석(13)을 위한 간단하고비용 효율적이며 높은 처리량 방법이다. HRM은 이미 EMS 돌연변이 유발 에 의해 유도된 SBS 돌연변이를 스크리닝하기 위한 HRM 기반 틸링(HRM-TILLING)을 포함하는 식물 연구에서 널리 사용되고 있다14. 여기에서, 우리는 쌀에 있는 감마 (γ) 광선에 의해 유도된 돌연변이 (인델 및 SBS 둘 다)의 검열을 위한 상세한 HRM-TILLING 프로토콜을 제시했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING은 유전자 기능 분석 및 작물 사육을 위한 유도된 돌연변이를 식별하기 위한 강력한 역유전 적 도구임이 입증되었습니다. 쉽게 관찰되거나 결정되지 않은 일부 특성의 경우, 고처리량 PCR 기반 돌연변이 검출을 이용한 틸링은 상이한 유전자에 대한 돌연변이를 얻는 유용한 방법이 될 수 있다. HRM-TILLING 방법은 돌연변이 스크리닝을 위해 토마토12,밀11 및 포?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (No. 2016YFD0102103)과 중국의 국립 자연 과학 재단 (No.31701394)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
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