Summary

Identificación de mutaciones por fusión de alta resolución en una población de arroz

Published: September 02, 2019
doi:

Summary

En este artículo, presentamos el protocolo que se describe como análisis de fusión de alta resolución (HRM) basado en lesiones locales inducidas por objetivos en genomas (TILLING). Este método utiliza cambios de fluorescencia durante la fusión del dúplex de ADN y es adecuado para el cribado de alto rendimiento tanto de inserción/eliminación (Indel) como de substición de base única (SBS).

Abstract

Las lesiones locales inducidas por el objetivo en los genomas (TILLING) es una estrategia de genética inversa para el cribado de alto rendimiento de mutaciones inducidas. Sin embargo, el sistema TILLING tiene menos aplicabilidad para la detección de inserción/eliminación (Indel) y TILLING tradicional necesita pasos más complejos, como la digestión nucleasa CEL I y la electroforesis de gel. Para mejorar el rendimiento y la eficiencia de selección, y para hacer posible el cribado tanto de Indels como de substiciones de base única (SBS), se desarrolla un nuevo sistema TILLING basado en fusión de alta resolución (HRM). Aquí, presentamos un protocolo HRM-TILLING detallado y mostramos su aplicación en el cribado de mutaciones. Este método puede analizar las mutaciones de los amplicons de PCR midiendo la desnaturalización del ADN de doble cadena a altas temperaturas. El análisis HRM se realiza directamente después de PCR sin procesamiento adicional. Además, un método de extracción de ADN simple, seguro y rápido (SSF) se integra con HRM-TILLING para identificar tanto Indels como SBSs. Su simplicidad, robustez y alto rendimiento lo hacen potencialmente útil para la exploración de mutaciones en arroz y otros cultivos.

Introduction

Los mutantes son importantes recursos genéticos para la investigación de genómica funcional vegetal y la cría de nuevas variedades. Un enfoque genético directo (es decir, desde la selección mutante hasta la clonación genética o el desarrollo de variedades) solía ser el método principal y único para el uso de mutaciones inducidas hace unos 20 años. El desarrollo de un nuevo método de genética inversa, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) de McCallum et al.1 abrió un nuevo paradigma y desde entonces se ha aplicado en un gran número de especies animales y vegetales2. TILLING es particularmente útil para los rasgos de reproducción que son técnicamente difíciles o costosos de determinar (por ejemplo, resistencia a enfermedades, contenido mineral).

TILLING fue desarrollado inicialmente para mutaciones de puntos de detección inducidas por mutágenos químicos (por ejemplo, EMS1,3). Incluye los siguientes pasos: el establecimiento de una(s) población(es) TILLING; Preparación del ADN y agrupación de plantas individuales; Amplificación pcR del fragmento de ADN objetivo; heteroduplexes la formación por desnaturalización y recocido de los amplicones de PCR y la escisión por nucleasa CEL I; y la identificación de los individuos mutantes y sus lesiones moleculares específicas3,4. Sin embargo, este método sigue siendo relativamente complejo, consume mucho tiempo y de bajo rendimiento. Para hacerlo más eficiente y con un mayor rendimiento, se han desarrollado muchos métodos TILLING modificados, como la eliminación TILLING (De-TILLING) (Tabla1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.

El análisis de curvas HRM, que se basa en cambios en la fluorescencia durante la fusión del dúplex de ADN, es un método simple, rentable y de alto rendimiento para el cribado de mutaciones y el genotipado13. HRM ya ha sido ampliamente utilizado en la investigación de plantas incluyendo TILLING basado en HRM (HRM-TILLING) para el cribado de mutaciones SBS inducidas por EMS mutagenesis14. Aquí, presentamos protocolos detallados de HRM-TILLING para el cribado de mutaciones (tanto Indel como SBS) inducidas por rayos gamma en el arroz.

Protocol

1. Preparativos Desarrollo de poblaciones mutadas de rayos de la misma Tratar unas 20.000 semillas de arroz secas (con un contenido de humedad de alrededor del 14%) de una línea de arroz japonica (por ejemplo, DS552) con 137rayos gamma Cs a 100 Gy (1 Gy/min) en una instalación de irradiación (por ejemplo, célula gamma).NOTA: Las semillas utilizadas para el tratamiento deben tener una alta viabilidad (por ejemplo, con una tasa de germinación >85%)….

Representative Results

Análisis y análisis de HRM En total, se produjeron 1.140 muestras de ADN agrupadas de 4.560 M2 plántulas y se sometieron a amplificación de PCR. Se ampliaron dos fragmentos con el tamaño de 195 bp y 259 bp para OsLCT1 y SPDT, respectivamente (Tabla 2). La mayoría de las muestras tenían curvas de fusión no significativamente diferentes de la WT (F 0.05)…

Discussion

TILLING ha demostrado ser una poderosa herramienta genética inversa para identificar mutaciones inducidas para el análisis funcional de genes y la reproducción de cultivos. Para algunos rasgos que no se observan o determinan fácilmente, TILLING con detección de mutaciones basadas en PCR de alto rendimiento puede ser un método útil para obtener mutantes para diferentes genes. El método HRM-TILLING se ha utilizado en poblaciones mutadas en EMS de tomate12,trigo11 y vi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China (No. 2016YFD0102103) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.31701394).

Materials

2× Taq plus PCR Master Mix Tiangen, China KT201 PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plate Bio-rad, America MSP-9651 Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexus Eppendorf, German 6333000073 PCR amplification
LightScanner Idaho Technology, USA LCSN-ASY-0011 For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0 Idaho Technology, USA For analysis of the fluorescence change
EvaGreen Biotium, USA 31000-T Fluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000 Thermo Scientific, USA ND2000 For DNA quantification

References

  1. McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
  3. Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
  4. Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
  5. Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
  6. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
  7. Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
  8. Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
  9. Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
  10. Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
  11. Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
  12. Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
  13. Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
  14. Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
  15. Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
  16. Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
  17. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
  18. Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
  19. Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
  20. Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
  21. Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
  22. Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
check_url/59960?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Li, S., Yu, Y., Liu, S., Fu, H., Huang, J., Shu, Q., Tan, Y. Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice. J. Vis. Exp. (151), e59960, doi:10.3791/59960 (2019).

View Video