Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

זיהוי מוטציות על ידי ברזולוציה גבוהה התכה באוכלוסיית לעיבוד לקרקע של אורז

Published: September 2, 2019 doi: 10.3791/59960
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 4
1National Key Laboratory of Rice Biology, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Resources, Institute of Crop Science, Zhejiang University, 2Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang University, 4The New Countryside Development Institute at Zhejiang University

Summary

במאמר זה, אנו מציגים את הפרוטוקול המתואר כניתוח ההיתוך ברזולוציה גבוהה (HRM)-היעד מבוסס המושרה נגעים מקומיים Genomes (לעיבוד קרקע). שיטה זו משתמשת שינויים פלואורסצנטית במהלך ההיתוך של דופלקס ה-DNA והוא מתאים הקרנת תפוקה גבוהה של הן הכניסה/מחיקה (Indel) ו-substition בסיס יחיד (SBS).

Abstract

היעד המושרה נגעים מקומיים Genomes (לעיבוד קרקע) היא אסטרטגיה של גנטיקה הפוכה עבור הקרנת תפוקה גבוהה של מוטציות המושרה. עם זאת, למערכת לעיבוד קרקע יש פחות ישימות לצורך הכנסה/מחיקה (indel) ולעיבוד קרקע מסורתי צריך שלבים מורכבים יותר, כמו העיכול של CEL I נוקלאז ואלקטרופורזה ג'ל. כדי לשפר את יעילות התפוקה והבחירה, וכיצד להפוך את ההקרנה של שני האינדידלים והבסיס היחיד (SBSs) אפשרי, מערכת לעיבוד קרקע מבוססת (HRM) חדשה ברזולוציה גבוהה מפותחת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט HRM-לעיבוד קרקע ולהראות יישום שלה בהקרנה מוטציה. שיטה זו יכולה לנתח את המוטציות של ה-PCR הגברה על ידי מדידת הדנטורציה של דנ א כפול שנתקע בטמפרטורות גבוהות. ניתוח HRM מבוצע ישירות פוסט-PCR ללא עיבוד נוסף. יתר על כן, פשוטה, בטוחה ומהירה (SSF) שיטת הפקת DNA משולב עם HRM-לעיבוד לקרקע כדי לזהות הן Indels ו-SBSs. הפשטות שלה, חוסן ותפוקה גבוהה להפוך אותו שימושי לסריקת מוטציה אורז וגידולים אחרים.

Introduction

מוטציות הן משאבים גנטיים חשובים עבור צמח גנומיקה פונקציונלית מחקר ורבייה של זנים חדשים. הגישה הגנטית הקדמי (כלומר מתוך בחירת מוטציה לשכפול גנים או מגוון התפתחות) היתה השיטה העיקרית והבלעדית לשימוש של מוטציות המושרה על 20 שנה לפני. הפיתוח של שיטת גנטיקה הפוכה הרומן, לעיבוד קרקע (כיעד המושרה נגעים מקומיים Genomes) על ידי McCallum ואח '1 פתחה פרדיגמה חדשה והיא הוחלה מאז מספר רב של בעלי חיים ומינים צמח2. לעיבוד קרקע הוא שימושי במיוחד עבור תכונות רבייה כי הם מבחינה טכנית קשה או יקר להיקבע (למשל, עמידות למחלות, תוכן מינרלי).

לעיבוד הקרקע פותחה בתחילה עבור מוטציות פוינט הנגרמת על ידי מוטגנים כימיים (למשל, EMS1,3). הוא כולל את השלבים הבאים: הקמת אוכלוסיית לעיבוד קרקע (ים); ה-DNA הכנה ואיגוד של צמחים בודדים; הגברה של מקטע הדנ א של המטרה הטרודופלקסים היווצרות על ידי דנטורציה וריפוי של הגברה ומחשוף של ה-PCR באמצעות CEL I nuclease; ועל הנגעים המולקולריים. הספציפיים שלהם3,4 עם זאת, שיטה זו עדיין מורכבת יחסית, גוזלת זמן ותפוקה נמוכה. כדי להפוך אותה ליעילה יותר ובעלת תפוקה גבוהה יותר, פותחו שיטות רבות לעיבוד קרקע, כגון מחיקה לעיבוד קרקע (לפני הקרקע) (טבלה 1)1,3,5,6, . שבע,שמונה,תשע,10,11,12

הניתוח HRM עיקול, אשר מבוסס על שינויי הזריחה במהלך המסת ה-DNA דופלקס, הוא פשוט, חסכוני, והתפוקה גבוהה שיטה להקרנה מוטציה ו-הקלדה13. HRM כבר נעשה שימוש נרחב במחקר הצמח כולל מבוסס HRM לעיבוד קרקע (HRM-לעיבוד קרקע) עבור סינון מוטציות SBS הנגרמת על ידי EMS מוטגנזה14. כאן, הצגנו פרוטוקולים מפורטים HRM-לעיבוד קרקע להקרנה של מוטציות (הן Indel ו-SBS) הנגרמת על ידי גמא (γ) קרני אורז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ההכנות

  1. פיתוח מγ לאוכלוסיות מוטחות
    1. התייחס כ 20,000 זרעי אורז יבשים (עם תוכן לחות של ca. 14%) של קו אורז יפני (למשל, DS552) עם 137למדעי השורה ב-100 Gy (1 gy/min) במתקן הקרנה γ (למשל, תא גמא).
      הערה: זרעים המשמשים לטיפול צריך להיות בעל יכולת קיום גבוהה (למשל, עם קצב נביטה > 85%). מינון הקרנה עבור אורז indica יכול להיות גדל כדי 150 Gy.
    2. מזרעו את הזרעים לקרינה לאחר הנביטה על מיטה שתיל ושתילים השתלת בנפרד לשדה האורז ולצמוח לתוך האוכלוסיה M1 .
      הערה: זריעה ישירה של1 צמחים בדלילות יכולה גם להיות מוחלת על שמירת עלות העבודה. מניעת חציית M1 צמחים עם זנים אחרים של אורז באמצעות בידוד פיזי או ביולוגי אמצעים.
    3. בתפזורת-הקציר M2 זרעים מן1 צמחים, עם 1-2 זרעים מכל אחד בהלה1 , כדי ליצור a2 אוכלוסיה.
      הערה: בפועל ולמען הפשטות, הקציר של כל הזרעים של M1 ולאחר ערבוב מלא, חלק הוא שנדגמו ליצירת אוכלוסיה M2 .
    4. משרים כ 5,000 M2 זרעים במים עבור 24 (אינדיקה אורז)-36 (אורז יפני) h בטמפרטורת החדר. אז תן זרעים לנבוט ב 37 ° c עבור 2 ימים על נייר סינון לח מנות פטרי.
      הערה: יותר M2 זרעים יכולים להיות מונבטים לניתוח כדי להגדיל את ההסתברות של זיהוי מוטציות.
    5. מניחים את הזרעים מונבטים כדי לזריעה פאנלים עם חורים קטנים ולגדול אותם הידרופונטי עבור 3-4 שבועות בפתרון התרבות שונה מ יושידה ואח '15 בבית החממה עם 12 h photoperiod [בשעות היום (30 ± 2) ° צ' ולילה (24 ± 2) ° c].
  2. דגימה של רקמות עלה: גזור דיסק אחד (Φ ~ 2 מ"מ) מן העלה המורחבת במלואו של כל זריעה באותו מיקום באמצעות מנקב חור.
  3. הכנת פתרונות להפקת דנ א
    1. מאגר A: להוסיף 2 מ ל של 5 M NaOH ו 10 mL של 20% רצף 20 כדי להפוך את הנפח הסופי של 50 mL. מאגר הכנה טרי. לפני חילוץ הדי. אנ. איי
    2. מאגר B: להוסיף 20 מ ל של 1 M Tris-HCl (pH 8.0) ו 80 μL של 0.5 M EDTA לעשות נפח סופי של 100 mL.
  4. צבעי היסוד המולקולארית
    1. תחל ניתוח HRM: עיצוב התחל עבור הגברה של רצף היעד באמצעות תוכנה (למשל, פריימר Premier5) ולסנתז על ידי חברה מסחרית.
      הערה: בגלל hrm הוא פחות ישים על ניתוח של שברים ארוכים, ולכן, הגברה צריכה להיות פחות מ 400 Bp. קטעים עם גבוה מדי (> 75%) או נמוך מדי (< 25%) כמו כן, תוכן GC אינו טוב לניתוח HRM.
    2. התחל בקרת איכות: השתמש 24 סמנים SSR מופץ על 12 כרומוזומים אורז מ פנג ואח '16.

2. הפקת דנ א

  1. מניחים 4 דיסקים עלים לתוך כל טוב של 96-היטב PCR צלחת, להוסיף מאגר פתרון (50 mL/טוב). הקפאת הצלחת במקפיא של 80 ° c במשך 10 דקות.
  2. להקפיא את הצלחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הדגירה ב 95 ° c עבור 10 דקות.
  3. הוסף 50 μL של מאגר B לכל באר ומערבבים היטב על ידי vortexing.
  4. צנטריפוגה את הצלחת עבור 1 דקות ב 1,500 x g. הסופרנטאנט מוכן. לPCR

3. הגברה של הPCR

  1. PCR אופטימיזציה
    1. הוסיפו את הריאגנטים הבאים לכל ה-PCR היטב: 1 μL של דנ א (הסופרנטאנט בשלב 2.4), 5 μL של מיקס מאסטר 2x (המכיל מאגר של 2x PCR, 4 ממול/L MgCl2, 0.4 Minm/l 2 '-deאוקסיטבונאוסייד triphosphates (dNTPs), ו 50 U/ML TAQ DNA פולימראז, 0.2 μl כל אחד 10 לפני/L התחל, ולעשות נפח הסופי של עד 10 μl באמצעות המים חינם נוקלאז.
    2. השתמש בבלוק תרמי בעל יכולת הדרגתיות כדי לקבוע את טמפרטורת הריפוי המיטבית עבור כל קטע יעד באמצעות התוכנית הבאה של ה-PCR: 5 דקות ב-94 ° צ', ואחריו 40 מחזורים של 30 ב-94 ° c, 30 בשעה 52-62 ° צ' (טמפרטורת מעבר) ו -30 s ב-72 ° c. , עם הארכה הסופית ב 72 ° c עבור 8 דקות וחסימה ב -16 ° c.
    3. בחנו הגברה על 1% ג'ל לקביעת טמפרטורת הריפוי האופטימלית.
      הערה: טמפרטורת ריפוי אופטימלית צריכה לאפשר הגברה מסוימת של מקטע המטרה, ללא הגברה ומלא מדויקת של מטרות.
  2. PCR לניתוח HRM
    הערה: הצלחות תואמות hrm ו-DNA של M2 שתילים שחולצו כפי שמתואר בשלב 2.4 משמשים ל-PCR.
    1. בצע בדיקות בנפח הסופי של 10 μL, עם 1 μL של ה-DNA (סופרנטאנט), 5 μL של מיקס מאסטר 2x, 0.2 μL כל אחד 10 μc/L התחל, ו 1 μL של צבע זריחה 10x. בכל אחת מהלוחיות נמנים מדגם מסוג פראי אחד (WT) ובקרה אחת שלילית (ללא דנ א).
    2. להוסיף טיפה של שמן מינרלי כל טוב כדי למנוע אידוי.
    3. לאטום את הצלחת עם הסרט והצנטריפוגה ומכה דבק ב 1,000 x g עבור 1 דקות.
    4. הפעל את ה-PCR באמצעות טמפרטורת הריפוי האופטימיזציה.
      הערה: במקרים מסוימים, צבע הקרינה הפלואורסצנטית עלולה להשפיע על הגברה של ה-pcr, ולכן הצבע נוסף לאחר השלמת ה-pcr. במקרים כאלה, הצבע משולב לתוך גדילי ה-DNA על ידי הדאגנטיזה וריפוי.

4. HRM סריקה ואישור מוטציה

  1. הסר את הסרט דבק מלוחית והכנס את הצלחת לתוך מכונת HRM.
  2. בחר ' הפעלה חדשה ' מתפריט הקובץ או לחץ על לחצן הפעלה בחלק העליון של המסך.
  3. ציין את טמפרטורת ההתחלה והסיום עבור ההמיס מ-55 ° צ' עד 95 ° c.
    הערה: לאחר ההפעלה הראשונה, ניתן לקבוע את טווח הטמפרטורה הנמס עבור שבר מסוים; מכאן, הטמפרטורה להמיס יכול להיות מותאם לניתוח עוקבות של אותו שבר כדי לחסוך זמן.
  4. בחרו דוגמאות לניתוח התכה ברזולוציה גבוהה, לא לכלול דוגמאות דומות לפקד השלילי.
  5. לנרמל את עקומות ההיתוך יש התחלה זהה הסוף הזריחה. ודא באופן חזותי שסמני הטמפרטורה ' מינימום ' ו'נמוכה יותר של Max ' נמצאים באזור של עקומות.
  6. שמור ∆ F (הבדל של זריחה) רמת בהגדרת ברירת המחדל של 0.05.
  7. בחר את המשותף לעומת Variant מרשימת בחירת התקנים ובחר את הרגישות הרגילה.
  8. השתמש ב-WT כפקד; דגימות עם ערך ∆ F של ≥ 0.05 מ WT נחשבים להכיל צמח מוטציה.
  9. זיהוי ואישור של צמחי מוטציה.
    1. זהה את ארבעת הצמחים, שעליהם. כל בריכת המוטציות נעשתה
    2. לחלץ דנ א מכל אחד מצמחים אלה באמצעות שיטת CTAB לפי אלן ואח '17 עם כמה שינויים.
      הערה: dnase-Free rnase ו-naac אינם משמשים כאשר מיצוי ה-dna באמצעות שיטת ctab המתוארת על ידי אלן ואח '17, כמו איכות ה-DNA הוא מספיק טוב עבור PCR הגברה נוספת. להתאים את ה-DNA לריכוז הסופי של ~ 25 ng/μL לאחר הקוונפיקציה באמצעות ספקטרוסקופיה.
    3. להגביר את קטע המטרה באמצעות התחל והתוכנית באופן זהה לניתוח HRM.
    4. זיהוי נגעים מולקולריים ספציפיים על ידי רצף הגברה.
      הערה: לאחר סיום הגברה ה-PCR, שלח את ההגברה לחברה לקביעת רצף השורות. הנגע המולקולרי יכול להיות מזוהה על ידי השוואת הרצפים בין הצמח M2 ו WT.

5. בקרת איכות של מוטציות נבחרות עם סמנים מולקולריים

  1. לבצע PCR עבור 24 סמנים SSR בנפח הסופי של 10 μL עם 25 ng של דנ א גנומית (שחולצו באמצעות פרוטוקול CTAB), 5 μL של מיקס מאסטר 2x, 0.2 μL של כל אחד 10 μM התחל SSR.
  2. הפעל את ה-PCR באמצעות התוכנית הבאה: 5 דקות ב 94 ° c, ואחריו 30 מחזורים של 30 בשעה 94 ° c, 30 בתוך 55 ° צ' ו 30 בשעה 72 ° c, עם סיומת סופית ב-72 ° c עבור 7 דקות.
  3. הפרד את המגברה על שמונה% ג'ל פוליאקרילמיד וגלה פולימורפיזם של רסיסים מוחלקים על ידי כתמים מכסף18.
  4. השווה את משתני SSR של המשתנים שנבחרו ואת ה-WT.
    הערה: מוטציות המושרה לעיתים קרובות יש הhaplotypes זהה ל-wt שלהם, אם יותר מאשר אחד סמנים ssr שונים בין משתנה ו-wt, המשתנה הוא גבוה עשוי להיות מזהם גנטי (למשל, תערובת או צמח החוצה) ולא המושרה . מוטציה18

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקר וסריקה של HRM

בסך הכל, 1,140 במאגר דגימות DNA מ 4,560 M2 שתילים יוצרו ונתון הגברה PCR. שני שברי עם גודל של 195 bp ו 259 bp הוגברה עבור OsLCT1 ו spdt, בהתאמה (שולחן2). רוב הדגימות היו עקומות התכה לא שונה באופן משמעותי מן WT (ΔF < 0.05). עקומות HRM שונה באופן משמעותי מן WT (ΔF > 0.05) קובצו עם צבע (עם) שונים מ WT על ידי התוכנה (איור 1).

המוטציה והתדר

דגימת דנ א של שתיל בודד שימש הגברה והשבר המתאים היה ברצף. סוג מוטציה ומיקום על הגנים יכול להיות מאושר על ידי רצף כרומאטוגרמות (איור 2). שלושה מוטציות כולל שני Indels ואחד SBS זוהו מ 4,560 M2 שתילים (שולחן 2). נמצא שכל שלושת חלקי המוטציות הheterozygous באתר המוטציה (איור 2).

תדר המוטציה כאן המכונה תדירות המוטציה אירעה בגנום באוכלוסיית לעיבוד קרקע. בהתבסס על הנוסחה שלהלן, התגלה כי תדר המוטציה הסתכם בכ-1/690 kb.

Equation 1

Figure 1
איור 1: HRM-לעיבוד קרקע של M2 שתילים עבור מוטציות ב OsLCT1 (A, B) או Spdt (ג) גנים. סוג פראי נבחר התייחסות להתפתחות של עקומות הפרש פלואורסצנטית. המוטציות הראו עקומות HRM שונות באופן משמעותי עם ΔFs > 0.05 בטמפרטורות של 90.0-92.0 ° צ' ו 81.5-83.5 ° c, בהתאמה. דמות זו שונתה מ-Li et al.19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: רצפי כרומטוגרמות של שברי ממוקדות של מוטציות. התיבה מלבני מציין אתר heterozygous עם מוטציה של G → A ב 4304 bp של OsLCT1 (א); אחד נוקלאוטיד בודד הכנסה על 4240 bp של OsLCT1 מצוין על ידי חץ (ב); ו-TTC trinucleotide מחיקה במיקום של 5948-5950 bp של Spdt מצוין על ידי קו שחור (C). דמות זו שונתה מ-Li et al.19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קיצור השם המלא היתרונות או הישימות חסרונות פניה
לעיבוד מסורתי יעד המושרה נגעים מקומיים Genomes עבור מוטציות בנקודות הקרנה זמן ועלות לצרוך מקקאללאם ואח ', 2000; עד ואח ', 2003
לעיבוד לסביבה סוג אקולוגי-לעיבוד קרקע עבור מוטציות ההקרנה באוכלוסיות טבעיות רגישות נמוכה ויקרה קומאי ואח ', 2004
דה-לעיבוד קרקע מחיקה לעיבוד קרקע לצורך הקרנת מחיקה גדולה תלוי בעוצמה במערכת ה-PCR הטובה רוג'רס ואח ', 2009
לעיבוד קרקע לעיבוד קרקע מותאמת אישית זיהוי מוטציות באמצעות אוכלוסיות TIILLING אישית לא אוכלוסיית קבע בוש וקריסאן, 2010
מכונות-לעיבוד לוגי הרפתקאות באיכות גבוהה כרומטוגרפיה נוזלית מבוססי לעיבוד קרקע חסכון בזמן תפוקה נמוכה קולאסוננו ואח ', 2016
Seq-לעיבוד קרקע לעיבוד קרקע לפי רצף תפוקה גבוהה, מערכת לא אנזימטית גבוה יחסית וחיובי שווא טסאי ואח ', 2011; קומאר ואח ' אל, 2017
מכונות לעיבוד קרקע התכה ברזולוציה גבוהה-לעיבוד קרקע תפוקה גבוהה וחיסכון בזמן; מערכת לא אנזימטית גבול אורך קטע ה-PCR דונג ואח ', 2009; עדי ואח ', 2009

שולחן 1: היתרונות והחסרונות של שיטות לעיבוד קרקע שונות.

שם גן ג'ין היכן פונקציית גן תחל רצף (5 '-3 ') Tm לאחר אופטימיזציה (° צ') גודל מוצר (bp) מספר מוטציות (סוג מוטציה)
OsLCT1 LOC_Os06g38120 מוביל קדמיום נמוך LCT-F: מרכז התמיכה של הקרן הסינית: הגנה מפני שימוש ב 61 195 2 (G-A מעבר, הכנסה 1-bp)
מיכל בע LOC_Os06g05160 מוביל הפצת זרחן בדומה ל-SULTR SPDT-F: מחלקה שלמה של הבית: הגנה מפני שליטת הקובץ 52 259 1 (3-bp מחיקה)

שולחן 2: מידע של שני גנים היעד, PCR הגברה מוטציות זיהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לעיבוד קרקע הוכיחה להיות כלי גנטי עוצמה הפוכה לזיהוי מוטציות המושרה עבור ניתוח פונקציונלי גנטי הרבייה יבול. עבור תכונות מסוימות לא בקלות נצפתה או נחוש, לעיבוד קרקע עם זיהוי מוטציה בתפוקה גבוהה PCR המבוסס יכול להיות שיטה שימושית כדי להשיג מוטציות עבור גנים שונים. שיטת "HRM-לעיבוד קרקע" שימש באוכלוסיות EMS-מוטזשות של עגבניה12, חיטה11 וגפן20 להקרנה מוטציה. במאמר זה, פשוט יותר וחזק יותר HRM-לעיבוד קרקע הוכח, החל עבור הקרנת המוטציה Indel ו SBS.

כדי לשפר את היעילות, DNAs חולצו באמצעות שיטת SSF במקום שיטת CTAB הרגיל, שהוא זמן-וצורכת עבודה ודורש סוכנים כימיים רעילים. Si ואח '21 בהשוואה לאיכות ה-DNA שחולצו באמצעות שיטת ssf ו-ctab. למרות שנמצא כי ה-DNA מהפקת SSF היה נחות טוהר זה של החילוץ CTAB, זה יכול לעמוד בדרישות ה-PCR וניתוח HRM באורז. עם זאת, יש לציין כי הדנ א מחילוץ SSF לא יכול להיות מאוחסן זמן רב, ולכן הוא אינו מתאים להקמת ספריית מוטציה קבועה.

במחקר קודם, דגימות במאגר עם ה-DNA מוטציה 1/8 יכול להיות מובחנת מן הסוג פראי על ידי הניתוח hrm הן באוכלוסיות EMS ו גאמה מוטנzed14,19. בהתחשב M2 צמחים יכול להיות heterozygous עבור מוטציות המושרה, האגירה של ארבעה M2 צמחים הומלץ לגילוי מוטציות על ידי HRM-לעיבוד קרקע.

כדי להשיג עוד מוטציות, זה גם קריטי לפתח אוכלוסיות מוטאנטים עם תדר מוטציה גבוהה. קרני גמא השפעה משמעותית על הצמיחה של M1 צמחים. זה דווח כי הטיפול עם מינון גבוה יותר הביא תדירות מוגברת של מוטציות כלורופיל לקויה ביצועים נחותים של פוריות, להגדיר זרעים וגובה הצמח ב M2 צמחים18. יתרה מזאת, ידוע כי סובלנות למוטגנים מגוונת בין מינים שונים. לכן, המינון הנובע כ 50% הסטלאליות (LD50) ב M1 צמחים נחשב כמינון אופטימלי הקרנה. עם זאת, לי ואח ' מצאו מינונים שונים (165, 246 ו 389 Gy) הביא שיעורי מוטציה דומה בגנום כולו על ידי רצף מחדש, אשר משתמע מינון נמוך יכול להיות מיושם כדי ליצור מוטציות22.

נייר זה הראה את הדוגמה של HRM-לעיבוד קרקע עבור הקרנת מוטציה של צמחים המושרה גמא. התואר HRM-לעיבוד קרקע המתואר במאמר זה צריך גם להיות ישים לצורך סינון מוטציות באוכלוסיות EMS-מוטייזאד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (No 2016YFD0102103) והקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. 31701394).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2× Taq plus PCR Master Mix Tiangen, China KT201 PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plate Bio-rad, America MSP-9651 Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexus Eppendorf, German 6333000073 PCR amplification
LightScanner Idaho Technology, USA LCSN-ASY-0011 For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0 Idaho Technology, USA For analysis of the fluorescence change
EvaGreen Biotium, USA 31000-T Fluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000 Thermo Scientific, USA ND2000 For DNA quantification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
  3. Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
  4. Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
  5. Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
  6. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
  7. Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
  8. Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
  9. Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
  10. Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
  11. Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
  12. Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
  13. Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
  14. Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
  15. Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , Manila, the Philippines. (1976).
  16. Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
  17. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
  18. Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
  19. Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
  20. Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
  21. Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
  22. Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).

Tags

גנטיקה סוגיה 151 ניתוח התכה ברזולוציה גבוהה HRM לעיבוד קרקע הקרנת מוטציה Indel ו-SBS קרני גמא אורז
זיהוי מוטציות על ידי ברזולוציה גבוהה התכה באוכלוסיית לעיבוד לקרקע של אורז
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S., Yu, Y. P., Liu, S. M., Fu,… More

Li, S., Yu, Y. P., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice. J. Vis. Exp. (151), e59960, doi:10.3791/59960 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter