Identificering af mutationer ved høj opløsning smelter i en TILLING population af ris
Summary
I denne artikel præsenterer vi den protokol, der er beskrevet som høj opløsning smelte analyse (HRM)-baseret Target induceret lokale læsioner i genomer (TILLING). Denne metode udnytter fluorescens ændringer under smeltning af DNA-duplex og er egnet til høj gennemløbs screening af både indsættelse/sletning (Indel) og enkelt base substition (SBS).
Abstract
Target inducerede lokale læsioner i genomer (TILLING) er en strategi for reverse Genetics for high-gennemløb screening af inducerede mutationer. Men, TILLING system har mindre anvendelighed til indsættelse/sletning (Indel) detektion og traditionelle TILLING behov mere komplekse trin, ligesom CEL I nuclease fordøjelse og gel elektroforese. For at forbedre gennemløbs-og udvælgelses effektiviteten, og for at gøre screeningen af både indels og enkelt base substitions (SBSs) muligt, udvikles et nyt højopløsnings-smelte system (HRM). Her præsenterer vi en detaljeret HRM-TILLING protokol og viser dens anvendelse i mutation screening. Denne metode kan analysere mutationer af PCR amplikoner ved at måle denaturering af dobbeltstrenget DNA ved høje temperaturer. HRM-analyse udføres direkte efter PCR uden yderligere behandling. Desuden er en enkel, sikker og hurtig (SSF) DNA-ekstraktionsmetode integreret med HRM-TILLING for at identificere både indels og SBSs. Dens enkelhed, robusthed og høje gennemløb gør det potentielt nyttigt for mutation scanning i ris og andre afgrøder.
Introduction
Mutanter er vigtige genetiske ressourcer til plante funktionel genomforskning og avl af nye sorter. En Forward genetik tilgang (dvs. fra mutant udvælgelse til genkloning eller variation udvikling) plejede at være den vigtigste og eneste metode til brug af inducerede mutationer omkring 20 år siden. Udviklingen af en ny reverse Genetics-metode, TILLING (målretning af inducerede lokale læsioner i genomer) af McCallum et al.1 åbnede et nyt paradigme, og det er siden blevet anvendt i et stort antal dyre-og plantearter2. TILLING er især nyttig for avls egenskaber, der er teknisk vanskelige eller dyre at fastsættes (f. eks. sygdomsresistens, mineralindhold).
Tilling blev oprindeligt udviklet til screening punktmutationer induceret af kemiske mutagener (f. eks. EMS1,3). Det omfatter følgende trin: etablering af en eller andre TILLING af befolkningsgrupper; DNA-forberedelse og pooling af individuelle planter PCR amplifikation af Target DNA fragment; heteroduplexer dannelse ved denaturering og Udglødning af PCR amplikoner og spaltning af cel I nuclease; og identifikation af mutante individer og deres specifikke molekylære læsioner3,4. Denne metode er dog stadig relativt kompleks, tidskrævende og lav gennemløb. For at gøre det mere effektivt og med højere gennemløb er der udviklet mange modificerede tilling metoder, såsom sletning af fliser (de-tilling) (tabel 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
HRM-kurve analyse, som er baseret på fluorescens ændringer under smeltning af DNA-duplex, er en enkel, omkostningseffektiv og High-gennemløb metode til mutation screening og genotypebestemmelse13. HRM har allerede været meget anvendt i plante forskning, herunder HRM-baseret TILLING (HRM-TILLING) til screening SBS-mutationer induceret af EMS mutagenese14. Her præsenterede vi detaljerede HRM-TILLING protokoller for screening af mutationer (både Indel og SBS) induceret af gamma (γ) stråler i ris.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING har vist sig at være et kraftfuldt omvendt genetisk værktøj til identificering af inducerede mutationer til genfunktionel analyse og afgrøde opdræt. For nogle egenskaber, der ikke let observeres eller bestemmes, kan VIPNING med PCR-baseret mutation detektion med høj gennemløb være en nyttig metode til at opnå mutanter til forskellige gener. HRM-TILLING metode har været anvendt i EMS-mutagenicerede populationer af tomat12, hvede11 og Grapevine<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Kinas nationale nøgle forsknings-og udviklings program (nr. 2016YFD0102103) og Kinas National Natural Science Foundation (nr. 31701394).
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
