米の耕作集団における高解像度溶融による変異の同定
Summary
本稿では、ゲノムにおける高分解能融解分析(HRM)ベースの標的誘導局所病変(TILLING)として説明されているプロトコルを紹介する。この方法は、DNA二重の融解時の蛍光変化を利用し、挿入/欠失(Indel)および単塩基下属(SBS)の両方のハイスループットスクリーニングに適しています。
Abstract
ゲノムにおける標的誘発局所病変(TILLING)は、誘導変異のハイスループットスクリーニングのための逆遺伝学の戦略である。しかし、TILLINGシステムは挿入/欠失(Indel)検出の適用性が低く、従来のTILLINGはCEL Iヌクレアーゼ消化やゲル電気泳動のようなより複雑なステップを必要とします。スループットと選択効率を向上させ、インデルとシングルベース置換(SB)の両方のスクリーニングを可能にするために、新しい高解像度融解(HRM)ベースのTILLINGシステムが開発されました。ここでは、詳細なHRM-TILLINGプロトコルを提示し、変異スクリーニングにおけるその応用を示す。この方法は、高温での二本鎖DNAの変異を測定することにより、PCRアンプリコンの変異を解析することができる。HRM 分析は、追加の処理を行わずに PCR 後に直接実行されます。さらに、シンプルで安全で高速な(SSF)DNA抽出方法をHRM-TILLINGと統合し、インデルとSBの両方を識別します。そのシンプルさ、堅牢性と高いスループットは、米や他の作物の変異スキャンに潜在的に有用です。
Introduction
変異体は、植物機能ゲノミクスの研究と新品種の繁殖のための重要な遺伝資源です。フォワード遺伝学のアプローチ(すなわち、変異型の選択から遺伝子クローニングまたは多様性の発達まで)は、約20年前に誘発された突然変異を使用するための主かつ唯一の方法でした。McCallumら1による新しい逆遺伝学法の開発は、マッカラムら1による新しいパラダイムを開き、それ以来、多数の動植物種2に適用されている。TILLINGは、技術的に決定が困難または高価な形質(例えば、耐病性、ミネラル含有量)の繁殖に特に有用である。
TILLINGは当初、化学変異原(EMS1、3)によって誘導されるスクリーニング点変異のために開発された。これには、次の手順が含まれます: TILLING 人口の確立(s)。個々の植物のDNA調製とプール;標的DNA断片のPCR増幅;PCRアンプリコンの脱化およびアニーリングによるヘテロドプレックス形成およびCEL Iヌクレアーゼによる切断;変異体およびその特異的分子病変3,4の同定。ただし、この方法は比較的複雑で、時間がかかり、スループットが低い場合があります。より効率的で高いスループットを実現するために、削除ティリング(De-TILLING)(表1)1、3、5、6など、多くの変更されたTILLING方法が開発されています。 7,8,9,10,11,12.
DNA二重の融解中の蛍光変化に基づくHRM曲線分析は、変異スクリーニングおよびジェノタイピング13のためのシンプルで費用対効果の高い、ハイスループット法である。HRMは、EMS変異14によって誘導されるSBS変異をスクリーニングするためのHRMベースのティリング(HRM-TILLING)を含む植物研究に既に広く使用されている。ここでは、米中のγ(γ)線によって誘導される変異(インデルとSBSの両方)をスクリーニングするための詳細なHRM-TILLINGプロトコルを提示した。
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLINGは、遺伝子機能解析および作物の繁殖のために誘導された変異を同定するための強力な逆遺伝的ツールであることが証明されています。容易に観察または決定されないいくつかの形質のために、高スループットPCRベースの変異検出を用いたTILLINGは、異なる遺伝子の変異体を得るのに有用な方法であり得る。HRM-TILLING法は、変異スクリーニングのためにトマト12、小麦11?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(No.2016YFD0102103)と中国国家自然科学財団(No.31701394)によって支援されました。
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
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