Identifiera mutationer genom högupplöst smältning i en TILLING population av ris
Summary
I denna artikel presenterar vi det protokoll som beskrivs som högupplöst smält analys (HRM)-baserade mål inducerade lokala lesioner i genom (TILLING). Denna metod utnyttjar fluorescensförändringar under smältningen av DNA duplex och är lämplig för hög dataflöde screening av både införande/radering (indel) och Single Base substition (SBS).
Abstract
Mål inducerade lokala lesioner i genom (TILLING) är en strategi för omvänd genetik för den höga genomflödet screening av inducerade mutationer. Dock har TILLING systemet mindre tillämplighet för införande/radering (indel) detektering och traditionella JORDbearbetning behöver mer komplexa steg, som CEL I Nuclease matsmältning och gel elektrofores. För att förbättra genomflödet och urvalet effektivitet, och för att göra screening av både indels och Single Base Substitions (SBSs) möjligt, en ny högupplöst smältning (HRM)-baserade TILLING system utvecklas. Här presenterar vi en detaljerad HRM-TILLING protokoll och visa sin ansökan i mutation screening. Denna metod kan analysera mutationer av PCR amplikonerna genom att mäta denatureringen av dubbelsträngad DNA vid höga temperaturer. HRM-analys utförs direkt efter PCR utan ytterligare bearbetning. Dessutom är en enkel, säker och snabb (SSF) DNA-extraktionsmetod integrerad med HRM-TILLING för att identifiera både indels och SBSs. Dess enkelhet, robusthet och höga genomströmning gör det potentiellt användbart för mutation skanning i ris och andra grödor.
Introduction
Mutanter är viktiga genetiska resurser för växt funktionell genomik forskning och avel av nya sorter. En Forward genetik metod (dvs. från muterat urval till gen kloning eller variation utveckling) brukade vara den viktigaste och enda metoden för användning av inducerade mutationer för ungefär 20 år sedan. Utvecklingen av en ny omvänd genetik metod, TILLING (inriktning inducerad lokala lesioner i genom) av McCallum et al.1 öppnat ett nytt paradigm och det har sedan dess tillämpats i ett stort antal djur-och växtarter2. TILLING är särskilt användbart för avels egenskaper som är tekniskt svåra eller kostsamma att fastställa (t. ex. sjukdoms beständighet, mineralhalt).
Tilling utvecklades initialt för screening punktmutationer induceras av kemiska mutagena (t. ex., EMS1,3). Det omfattar följande steg: upprättande av en population (er) av en TILLING. DNA-beredning och sammanslagning av enskilda växter; PCR-förstärkning av mål-DNA-fragment; heteroduplex bildas genom denaturering och glödgning av PCR amplikonerna och klyvning av cel I Nuclease; och identifiering av muterade individer och deras specifika molekylära lesioner3,4. Den här metoden är dock fortfarande relativt komplicerad, tidskrävande och låg dataflöde. För att göra den mer effektiv och med högre genomströmning har många modifierade jord bearbetningsmetoder utvecklats, till exempel borttagande av tilling (tabell 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
HRM Curve analys, som bygger på fluorescens förändringar under smältning av DNA duplex, är en enkel, kostnadseffektiv, och hög genomströmning metod för mutation screening och genotypning13. HRM har redan använts i stor utsträckning i växtforskning inklusive HRM-baserade JORDbearbetning (HRM-TILLING) för screening SBS mutationer induceras av EMS mutagenes14. Här presenterade vi detaljerade HRM-TILLING protokoll för screening av mutationer (både indel och SBS) induceras av gamma (γ) strålar i ris.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING har visat sig vara ett kraftfullt omvänt genetiskt verktyg för att identifiera inducerade mutationer för gen funktionell analys och grödan avel. För vissa egenskaper som inte lätt observeras eller bestäms, kan TILLING med hög genomströmning PCR-baserad mutation upptäckt vara en användbar metod för att få mutanter för olika gener. HRM-TILLING metod har använts i EMS-mutagenized populationer av tomat12, vete11 och Grapevine20 fö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av det nationella centrala forsknings-och utvecklingsprogrammet i Kina (nr 2016YFD0102103) och Kinas National Natural Science Foundation (nr 31701394).
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
