I denna artikel presenterar vi det protokoll som beskrivs som högupplöst smält analys (HRM)-baserade mål inducerade lokala lesioner i genom (TILLING). Denna metod utnyttjar fluorescensförändringar under smältningen av DNA duplex och är lämplig för hög dataflöde screening av både införande/radering (indel) och Single Base substition (SBS).
Mål inducerade lokala lesioner i genom (TILLING) är en strategi för omvänd genetik för den höga genomflödet screening av inducerade mutationer. Dock har TILLING systemet mindre tillämplighet för införande/radering (indel) detektering och traditionella JORDbearbetning behöver mer komplexa steg, som CEL I Nuclease matsmältning och gel elektrofores. För att förbättra genomflödet och urvalet effektivitet, och för att göra screening av både indels och Single Base Substitions (SBSs) möjligt, en ny högupplöst smältning (HRM)-baserade TILLING system utvecklas. Här presenterar vi en detaljerad HRM-TILLING protokoll och visa sin ansökan i mutation screening. Denna metod kan analysera mutationer av PCR amplikonerna genom att mäta denatureringen av dubbelsträngad DNA vid höga temperaturer. HRM-analys utförs direkt efter PCR utan ytterligare bearbetning. Dessutom är en enkel, säker och snabb (SSF) DNA-extraktionsmetod integrerad med HRM-TILLING för att identifiera både indels och SBSs. Dess enkelhet, robusthet och höga genomströmning gör det potentiellt användbart för mutation skanning i ris och andra grödor.
Mutanter är viktiga genetiska resurser för växt funktionell genomik forskning och avel av nya sorter. En Forward genetik metod (dvs. från muterat urval till gen kloning eller variation utveckling) brukade vara den viktigaste och enda metoden för användning av inducerade mutationer för ungefär 20 år sedan. Utvecklingen av en ny omvänd genetik metod, TILLING (inriktning inducerad lokala lesioner i genom) av McCallum et al.1 öppnat ett nytt paradigm och det har sedan dess tillämpats i ett stort antal djur-och växtarter2. TILLING är särskilt användbart för avels egenskaper som är tekniskt svåra eller kostsamma att fastställa (t. ex. sjukdoms beständighet, mineralhalt).
Tilling utvecklades initialt för screening punktmutationer induceras av kemiska mutagena (t. ex., EMS1,3). Det omfattar följande steg: upprättande av en population (er) av en TILLING. DNA-beredning och sammanslagning av enskilda växter; PCR-förstärkning av mål-DNA-fragment; heteroduplex bildas genom denaturering och glödgning av PCR amplikonerna och klyvning av cel I Nuclease; och identifiering av muterade individer och deras specifika molekylära lesioner3,4. Den här metoden är dock fortfarande relativt komplicerad, tidskrävande och låg dataflöde. För att göra den mer effektiv och med högre genomströmning har många modifierade jord bearbetningsmetoder utvecklats, till exempel borttagande av tilling (tabell 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
HRM Curve analys, som bygger på fluorescens förändringar under smältning av DNA duplex, är en enkel, kostnadseffektiv, och hög genomströmning metod för mutation screening och genotypning13. HRM har redan använts i stor utsträckning i växtforskning inklusive HRM-baserade JORDbearbetning (HRM-TILLING) för screening SBS mutationer induceras av EMS mutagenes14. Här presenterade vi detaljerade HRM-TILLING protokoll för screening av mutationer (både indel och SBS) induceras av gamma (γ) strålar i ris.
TILLING har visat sig vara ett kraftfullt omvänt genetiskt verktyg för att identifiera inducerade mutationer för gen funktionell analys och grödan avel. För vissa egenskaper som inte lätt observeras eller bestäms, kan TILLING med hög genomströmning PCR-baserad mutation upptäckt vara en användbar metod för att få mutanter för olika gener. HRM-TILLING metod har använts i EMS-mutagenized populationer av tomat12, vete11 och Grapevine20 fö…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det nationella centrala forsknings-och utvecklingsprogrammet i Kina (nr 2016YFD0102103) och Kinas National Natural Science Foundation (nr 31701394).
2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |