Summary
Vi presenterar ett detaljerat litet RNA-biblioteks reparations protokoll med mindre bias än standardmetoder och en ökad känslighet för 2-O-metyl-RNAs. Detta protokoll kan följas med hemgjorda reagenser för att spara kostnader eller använda byggsatser för enkelhetens skull.
Abstract
Studiet av små RNAs (sRNAs) med nästa generations sekvensering (NGS) utmanas av bias-problem under biblioteks förberedelse. Flera typer av sRNA såsom Plant microRNAs (miRNAs) bär en 2 '-O-metyl (2 '-OMe) modifiering vid deras 3 ' Terminal nukleotid. Denna modifiering tillför en annan svårighet eftersom det hämmar 3 ' adapter ligation. Vi har tidigare visat att modifierade versioner av protokollet TruSeq (TS) har mindre bias och en förbättrad detektion av 2-OMe RNAs. Här beskriver vi i detalj protokoll "TS5", som visade den bästa totala prestandan. TS5 kan följas antingen med hemgjorda reagenser eller reagenser från TS kit, med samma prestanda.
Introduction
Små RNAs (sRNAs) är involverade i kontrollen av en mångfald av biologiska processer1. Eukaryotiska regulatoriska sRNAs är vanligtvis mellan 20 och 30 NT i storlek; de tre huvudtyperna är microRNAs (miRNA), piwi-interagerande RNAs (piRNA) och små störande RNAs (siRNA). Avvikande miRNA uttrycks nivåer har varit inblandade i en mängd olika sjukdomar2. Detta understryker betydelsen av miRNAs i hälsa och sjukdom och kravet på korrekta, kvantitativa forskningsverktyg för att upptäcka sRNAs i allmänhet.
Nästa generations sekvensering (NGS) är en allmänt använd metod för att studera sRNAs. Huvudsakliga fördelar med NGS jämfört med andra metoder, såsom kvantitativa PCR eller microarray tekniker (qPCR), är att det inte behöver en priori kunskap om sRNA sekvenser och kan därför användas för att upptäcka nya RNAs, och dessutom lider mindre av bakgrunds signal och mättnadseffekter. Ytterligare, det kan upptäcka enstaka nukleotid skillnader och har en högre genomströmning än Microarrays. Men NGS har också vissanackdelar; kostnaden för en sekvenserings körning är fortfarande relativt hög och i flera steg-processen som krävs för att omvandla ett prov till ett bibliotek för sekvensering kan introducera fördomar. I en typisk Srna bibliotek förberedelseprocess, en 3 ' adapter är först och ligaturer till Srna (ofta gel-renas från totalt RNA) med en stympad version av RNA Ligase 2 (RNL2) och en preadenylated 3 ' adapter (figur 1) i avsaknad av ATP. Detta ökar effektiviteten av sRNA-adapter ligering och minskar bildandet av sidoreaktioner såsom sRNA circularization eller concatemerization. Därefter, en 5 ' adapter är och ligaturer av RNA Ligase 1 (RNL1), följt av omvänd Transkription (RT) och PCR amplifiering. Alla dessa steg kan införa bias3,4. Läs numren återspeglar därför inte de faktiska sRNA-uttrycksnivåer som leder till artificiella, metod beroende uttrycksmönster. Specifika sRNAs kan vara antingen över-eller underrepresenterade i ett bibliotek och starkt underrepresenterade sRNAs kan undgå identifiering. Situationen är särskilt komplicerad med växt miRNAs, siRNAs i insekter och växter, och piRNAs i insekter, nematoder och däggdjur, där 3 ' Terminal nukleotid har en 2 '-O-metyl (2 '-OMe) modifiering1. Denna modifiering hämmar starkt 3 ' adapter ligering5, göra bibliotek förberedelse för dessa typer av RNA en svår uppgift.
Tidigare arbete visade att adapter ligering introducerar allvarlig bias, på grund av RNA-sekvens/struktureffekter6,7,8,9,10,11. Steg nedströms av adapterligation såsom omvänd Transkription och PCR bidrar inte nämnvärt till bias6,11,12. Ligering bias beror sannolikt på det faktum att adaptern molekyler med en given sekvens kommer att interagera med sRNA molekyler i reaktionsblandningen att bilda Co-veck, som antingen kan leda till gynnsamma eller ogynnsamma konfigurationer för ligering (figur 2). Data från Sorefan et al7 tyder på att RNL1 föredrar en enda strandsatta sammanhang, medan RNL2 föredrar en dubbel strand för ligering. Det faktum att adaptern/sRNA Co-Fold strukturer bestäms av den specifika adaptern och sRNA sekvenser förklarar varför specifika sRNA är över-eller underrepresenterade med en given adapteruppsättning. Det är också viktigt att notera att i en serie sRNA bibliotek som ska jämföras, bör samma adaptersekvenser användas. Faktum är att det tidigare har observerats att byta adaptrar genom införandet av olika streckkod sekvenser förändrar Mirna profiler i sekvensering bibliotek9,13.
Randomisering av adaptersekvenser nära ligering korsningen sannolikt minskar dessa fördomar. Sorefan och kollegor7 begagnade adaptrar med 4 slumpmässiga nukleotider i extremiteter, utsedda "high definition" (HD) adaptrar, och visade att användningen av dessa adaptrar leda till bibliotek som bättre återspeglar sanna Srna uttrycks nivåer. Nyare arbete bekräftade dessa observationer och avslöjade att den randomiserade regionen inte behöver vara i anslutning till ligering Junction11. Denna roman typ av adaptrar hette "MidRand" adaptrar. Tillsammans visar dessa resultat att förbättrad adapterdesign kan minska bias.
Istället för att modifiera adaptrarna kan bias dämpas genom optimering av reaktions förhållanden. Polyetylenglykol (PEG), en makromolekylär utträngning agent känd för att öka ligering effektivitet14, har visat sig avsevärt minska bias15,16. Baserat på dessa resultat, flera "Low bias" kit dök upp på marknaden. Dessa inkluderar kit som använder PEG i ligationsreaktionerna, antingen i kombination med klassiska adaptrar eller HD-adaptrar. Andra kit undvika ligering helt och hållet, och använda 3 ' polyadenylering och mall växling för 3 ' och 5 ' adapter addition, respektive12. I ännu en strategi, 3 ' adapter ligering följs av en circularization steg, därmed utelämna 5 ' adapter ligering17.
I en tidigare studie sökte vi efter en sRNA bibliotek förberedelse protokoll med lägsta möjliga nivåer av bias och den bästa upptäckten av 2 '-OMe RNAs12. Vi testade några av de ovan nämnda "Low bias" kit, som hade en bättre detektering av 2 '-OMe RNAs än standardprotokollet (TS). Överraskande dock, vid modifiering (användning av randomiserade adaptrar, PEG i ligering reaktioner och avlägsnande av överskott 3 ' adapter genom rening) den senare överpresterade andra protokoll för detektion av 2 '-OMe RNAs. Här beskriver vi i detalj ett protokoll baserat på TS-protokollet, "TS5", som hade den bästa övergripande upptäckten av 2 '-OMe RNAs. Protokollet kan följas med reagenser från TS kit och ett reagens från NF-satsen eller, för att spara pengar, med hjälp av hemgjorda reagenser, med samma prestanda. Vi tillhandahåller också ett detaljerat protokoll för rening av sRNA från totalt RNA och beredning av preadenylerad 3 ' adapter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolering av små RNAs
- Extrahera totalt RNA med fenolbaserade reagenser eller någon annan metod. Kontrollera om RNA är av god kvalitet.
- Pre-Run en 15% TBE-urea gel (se tabell över material) för 15 min vid 200 V.
- Medan gelen är pre-Running, blanda 5-20 μg totalt RNA i en 5-15 μL volym med en lika stor volym av formamid lastning färgämne (se tabell över material; 95% avjoniserat formamid, 0,025% bromfenolblått, 0,025% xylen cyanol, 5 mm EDTA pH 8) i ett 200 μl PCR-rör. Likaså blanda 10 μL (200 ng) av små-RNA stege (se tabell över material) med en lika volym av formamid lastning färgämne. Inkubera i 5 min vid 65 ° c i en termocycler med uppvärmt lock och placera sedan rören omedelbart på isen.
- Ladda stegen och provet på samma gel med minst ett körfält mellan dem och kör på 200 V tills bromfenolblått (mörkblå) har migrerat ungefär två tredjedelen av Gelens längd (ca 40 min).
- Förbered ett system för att eluera RNA från gel enligt följande: punktera botten av en nukleasfri 0,5 mL Micro centrifug tub med en 21-gauge nål. Placera den punkterade 0,5 mL-röret i ett nukleasfritt rund-botten 2 mL Micro centrifug tub.
- Ta bort gelen, och inkubera vid rumstemperatur med 3 μL nukleinsyraforgel (10 000 x koncentrat; se tabell över material) i 30 ml vatten för 10-15 min.
- Visa gelen på en "Dark Reader" Trans illuminator (det rekommenderas starkt att undvika UV eftersom detta kan skada RNA) och skär ut provet RNA mellan 17 NT och 29 NT stege band. Överför gel biten till 0,5 mL-röret från steg 1,5.
- Centrifugera 0,5 mL-röret i 2 mL-röret i en mikrocentrifug med högsta hastighet i 2 min. ta bort 0,5 mL röret, som bör vara tom nu.
- Tillsätt 300 μL av Nuclease-fri 0,3 M NaCl till 2 mL-röret som innehåller den krossade gelen och rotera i minst 2 h vid rumstemperatur eller vid 4 ° c över natten (16 h).
- Överför upphängningen av krossade gel bitar till en snurrande kolonn (se tabell över material) och Centrifugera i 2 minuter med maximal hastighet i en mikrocentrifug.
- Tillsätt 1 μL (20 μg/μL) glykogen (se tabell över material) och 950 μl rumstemperatur 100% etanol. Inkubera i minst 30 min vid-80 ° c.
- Centrifugera i 20 minuter med maximal hastighet i en mikrocentrifug vid 4 ° c. Ta bort supernatanten, tvätta pelleten med 800 μL kall 80% etanol. Centrifugera igen i 5 min vid 4 ° c och ta försiktigt bort alla supernatanten. Omsuspendera RNA-pelleten i 15 μL nukleasfritt vatten. Typiskt, ~ 5-20 ng av små RNA bör återvinnas, beroende på mängden input totalt RNA (~ 1 ng av små RNA per 1 μg input totalt RNA).
- Rekommenderade ytterligare steg: Kontrollera kvantiteten och kvaliteten på den återvunna sRNA (t. ex. genom kapillärgel elektrofores med hjälp av ett litet RNA-kit; se tabell över material).
2. beredning av preadenylerad 3 ' HD-adapter
Anmärkning: Preadenylering av 3 ' HD adapter gjordes på ett sätt som liknar det protokoll som beskrivs av Chen et al18. Observera att preadenylated adapter kan beställas direkt (/5rappa/modifiering), men detta är ganska dyrt.
- Beställ 5 ' fosforylerad, 3 ' blockerad 3 ' HD-adapter oligonukleotid. Se tabell 1 för sekvens och modifieringar. Observera att "3AmMO" är en 3 ' amino modifier Group, de flesta leverantörer kan producera oligonukleotid med denna modifiering. Späd i nukleasfritt vatten till 100 μM.
- Ställ in en 100 μL-reaktion som innehåller följande reagenser: 10 μL oligo (100 μM), 10 μL T4 RNA-ligasbuffert (10X), 10 μL ATP (10 mM), 40 μL av 50% PEG8000 μL av T4 RNA Ligas 1 (50 enheter), 25 μL nukleasfritt vatten. Inkubera över natten vid 20 ° c.
- Utföra en klassisk fenol-kloroformextraktion av preadenylerade oligonukleotid följt av etanol nederbörd. Tillsätt 100 μL syra (pH 4,5) fenol: kloroform och Vortex. Snurra i 5 minuter vid rumstemperatur, max hastighet. Överför försiktigt 90 μL av den övre fasen till ett nytt rör; Tillsätt 10 μL av 3 M natriumacetat pH 5,2, 1 μL ultra-ren glykogen och 250 μL kallt 100% etanol.
- Håll vid-20 ° c i minst 30 min. Centrifugera i 30 min vid 4 ° c max hastighet. Avlägsna supernatanten, tvätta pelleten en gång med 500 μL kallt 80% etanol. Som ett alternativ till fenol-kloroformextraktion och etanol nederbörd kan en nukleotidborttagningssats användas (se tabell över material). Omsuspenderas i 25 μL vatten.
- Mät adapterns koncentration med hjälp av ett kit för specifik detektion av enkelsträngat DNA (se tabell över material). Späd till 80 ng/μL (10 μM).
- Rekommenderade ytterligare steg: Kontrollera preadenylationseffekten genom att migrera 1 μL 10 μM adapter på en 15% TBE-urea-gel (tabell över material) tillsammans med obehandlad oligonukleotid. Den preadenylerade adaptern bör migrera något långsammare än obehandlad oligonukleotid. Om så önskas, den preadenylerade adaptern kan gel-renas; Fortsätt enligt beskrivningen ovan (steg 1.2-1.12).
3. upprättande av bibliotek-protokoll TS5
Notera: Vi presenterar här det modifierade TS-protokollet "TS5" som vi beskrev tidigare12 och som kan utföras antingen med reagenser från satsen eller med självförsörjande reagenser. Det bör noteras att vi fick liknande eller till och med något bättre resultat med ett annat protokoll, "TS7". Men med TS7 är det svårare att eliminera adaptern dimers. Vi har därför föredragit att beskriva TS5 i detalj, men TS7 kan följas genom att helt enkelt byta ut adaptrarna. För TS7 Använd adaptersekvenserna "MidRand-like (MRL)" (tabell 1). Observera att här de randomiserade regionerna är i mitten av adaptrarna. Primers för omvänd Transkription och PCR kommer hybridisera till sekvenser nedströms i den randomiserade regionen i 3 ' adaptern och uppströms den randomiserade regionen i 5 ' adapter. Sekvensering kommer att starta från den första randomiserade nukleotiden i 5 ' adaptern.
- 3 ' adapter ligation.
- Kombinera 1 μL preadenylerad 3 ' HD-adapter (10 μM) med 1 μL renat litet RNA (~ 0,1-1 μM) i en 0,2 mL Micro centrifug tub. Inkubera i 2 min vid 72 ° c i en Thermo Cycler, sedan sätta direkt på isen.
- Tillsätt 4 μL 50% PEG 8000 (trögflytande lösning; Pipettera långsamt), 1 μL RNA-ligasbuffert (10X), 1 μL H2O, 1 μl T4 RNA ligase2 stympad och 1 μl rnashämmare. Inkubera över natten vid 16 ° c.
- Eliminering av unligated 3 ' adapter
- Tillsätt 10 μL nukleasfritt vatten och blanda väl. Tillsätt 6 μL av 3 M NaOAc pH 5,2 eller "adapter utarmning lösning" från NF Kit (tabell över material) och blanda väl. Tillsätt 40 μL magnetiska renings kulor (tabell över material) och 60 μl isopropanol och blanda väl. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Sätt provet i ett magnet rack tills lösningen verkar klar. Ta bort och Kassera supernatanten.
- Tillsätt 180 μL nyberedd 80% etanol. Inkubera för ~ 30 s, ta sedan bort. Var noga med att använda nyberedd 80% etanol och inkubera inte med 80% etanol under längre perioder.
- Snurra snabbt röret och ta bort kvarvarande vätska som kan ha samlats på botten av brunnen. Låt pärlorna torka i 2 min, sedan Omsuspendera i 22 μL 10 mM Tris pH 8 eller resuspension buffert från NF kit. Inkubera i 2 minuter och magnetisera sedan provet tills lösningen verkar klar.
- Tillsätt 6 μL av 3 M NaOAc pH 5,2 eller "adapter utarmning lösning" från NF Kit (tabell över material) till ett nytt rör. Överför 20 μL av supernatanten från föregående steg till denna nya tub och blanda genom pipettering. Tillsätt 40 μL av de magnetiska pärlorna och 60 μL 100% isopropanol och blanda väl genom pipettering. Inkubera i 5 minuter.
- Magnetisera provet tills lösningen verkar klar, ta bort och Kassera supernatanten.
- Tillsätt 180 μL nyberedd 80% etanol. Inkubera för ~ 30 s, ta sedan bort. TAKE Care att använda nyberedd 80% etanol och inte Inkubera för med 80% etanol under längre perioder.
- Snurra snabbt röret och ta bort kvarvarande vätska som kan ha samlats på botten av brunnen. Låt pärlorna torka i 2 min, och Omsuspendera i 10 μL av Nuclease-fritt vatten. Inkubera i 2 minuter och magnetisera sedan provet tills lösningen verkar klar.
- Överför 9 μL supernatanten till ett nytt rör. Tillsätt 1 μL T4 RNA ligasbuffert (10X) och 1 μL vatten. Du kan också lägga till 2 μL ligasbuffert från TS-kitet.
- Ligering av 5-adapter.
- Tillsätt 1 μL 5 ' HD-adapter (10 μM; Tabell 1) till ett 200 μL PCR-rör i en termocykelapparat med uppvärmt lock. Inkubera i 2 min vid 70 ° c och Lägg sedan röret direkt på isen.
- Tillsätt 1 μL 10 mM ATP och 1 μL T4 RNA Ligas 1. Blanda väl genom att försiktigt Pipettera. Tillsätt 3 μl av denna blandning till 3 ' och ligaturer RNA från steg 3.2.9 och blanda genom pipettering. Inkubera i 1 h vid 28 ° c.
- Omvänd Transkription (RT)
- Överför 6 μl 3-och 5-adapterns och ligaturer RNA till ett nytt 200 μl PCR-rör (behåll resterande ~ 8 μl vid-80 ° c för senare användning vid behov). Tillsätt 1 μL RT-primer (10 μM; Tabell 1) och blanda genom pipettering. Inkubera i 2 min vid 70 ° c och Lägg sedan röret direkt på isen.
- Tillsätt följande reagenser för RT: 2 μL 5x första strandbuffert, 0,5 μL av 12,5 mM dNTP-blandning, 1 μL 100 mM DTT, 1 μL RNase-hämmare och 1 μL omvänt transkriptas (tabell över material). Inkubera i 1 h vid 50 ° c.
- PCR-amplifiering
- Tillsätt följande reagenser till 12,5 μL av RT-reaktionsblandningen: 10 μL PCR-polymerasbuffert, 2 μL universell P5-primer (10 μM; Tabell 1), 2 μl P7-indexprimer (10 μm; Tabell 1), 1 μl 12,5 mm dNTPs, 0,5 μl DNA-polymeras (tabell över material) och 22 μl vatten. Håll reaktionen på isen tills den används.
- Kör följande PCR-program: 98 ° c för 30 s, 11 cykler (98 ° c för 10 s, 60 ° c för 30 s och 72 ° c för 15 s) och 72 ° c i 10 min. Håll reaktionen vid 4 ° c när du är klar.
Anmärkning: när det gäller antalet PCR-cykler: Vi utför vanligtvis 11 cykler, men detta bör optimeras av användaren. Försök att utföra minsta möjliga antal PCR-cykler.
- Gel rening
- Kör 5, 10 och 20 μL PCR-produkt på en ursprunglig 6% TBE-gel (se tabell över material) tillsammans med en lämplig stege (se tabell över material). Kör gelen i ca 1 h vid 145 V (tills bromofenolblått når botten; denna färg migrerar på 65 BP position).
- Ta bort gelen, och inkubera med nukleinsyra gel fläck (se tabell över material) i vatten för 10-15 min.
- Visa gelen på en "Dark Reader" Trans illuminator (det rekommenderas starkt att undvika UV eftersom detta kan skada RNA) och klippa ut biblioteket bandet på 150 BP. Förbered ett system för att eluera RNA från gel som beskrivs i steg 1,5 och överföra gel bit till 0,5 mL röret.
- Centrifugera i en mikrocentrifug med maximal hastighet i 2 min. ta bort 0,5 mL röret, som bör vara tom nu.
- Tillsätt 300 μL nukleasfritt vatten till 2 mL-röret som innehåller den krossade gelen och rotera i minst 2 timmar vid rumstemperatur eller vid 4 ° c över natten.
- Överför upphängningen av krossade gel bitar i vatten till en snurrande kolonn och Centrifugera i 2 minuter med maximal hastighet.
- Tillsätt 1 μL (20 μg/μL) glykogen, 30 μL 3 M NaOAc och 975 μL iskall 100% etanol. Centrifugera i 20 minuter vid max hastighet vid 4 ° c.
- Omsuspendera pelleten i 20 μL 10 mM Tris pH8. Använd 1 μL för koncentrationsmätning och 1 μL för kvalitetskontroll.
4. analys av data
Obs: den dataanalys förfarande som beskrivs nedan är baserad på Linux operativsystem Ubuntu 16,04 LTS.
- Behandling av RAW Sequence-filer
- Hämta FASTQ sekvens fil (er) som genereras under sekvensering körningen. Vid behov, utföra demultiplexning med bcl2fastq2 (version V 2.2.18.12; en manual kan laddas ner från följande länk: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
Använd följande kommando:
nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq--runfolder-dir Pathway_of_Run --ignorera-saknad-BCL--output-dir Pathway_of_Output_Directory --streckkod-missmatchningar 1--aggregerad-plattor Auto-r 16-d 16-p 16-w 16 - Ta bort adaptersekvenser med Cutadapt19 version 1,15. En manual kan laddas ner här: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
Använd följande kommando:
Pathway_to_cutadapt/ cutadapt-en TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-n 5-O 4-m 10-j 0--nextseq-trim 10-O Output_File_Read1_cutadapt. fastq. gz Input_File_Read1. fastq. gz
Observera att sekvensen i kommandot motsvarar 3 ' HD-adaptern utan 4 slumpmässiga nukleotider; dessa kommer därför inte att tas bort under det här steget. - Använd seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) för avlägsnande av terminalen slumpmässiga nukleotider i sekvensering läsningar. Använd följande kommando (variabelnamn i fetstil):
seqtk trimfq-b 4-e 4 Output_File_Read1_cutadapt . fastq > Output_File_Read1 _ trimmad . fastq - Använd följande awk-kommando för att ta bort sekvenser som är kortare än 10 NT:
awk ' BEGIN {FS = "\t"; OFS = "\n"} {sidhuvud = $0; getline SEQ; getline qheader; getline qseq; IF (längd (SEQ) > = 10) {Skriv ut sidhuvud, seq, qheader, qseq}} ' Output_File_Read1_ trimmad. fastq > Length_Filtered. fastq
- Hämta FASTQ sekvens fil (er) som genereras under sekvensering körningen. Vid behov, utföra demultiplexning med bcl2fastq2 (version V 2.2.18.12; en manual kan laddas ner från följande länk: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
- Mappning av de trimmade sekvenserna
- Ladda ner databasen som motsvarar organismen av studien från miRBase enligt följande. Gå till http://www.mirbase.org/ftp.shtml och ladda ner "mature. FA"-filen. Observera att sekvenserna anges i RNA-notation. Ersätt U-rester med T med följande kommando:
sed-i '/^ >/! s/U/T/g ' mature. FA
Obs: detta kommer att ge en komplett lista över alla miRNAs i miRBase, som kommer från en mängd olika organismer. - Välj miRNA-sekvenser av din organism av intresse med följande kommando:
awk 'name_of_the_organism{Skriv ut; NR [nr + 1]; nästa}; NR i nr ' mature. FA > mature_name_of_the_organism_Mirs. FA - Mappa läsningar till den ovan skapade filen med Bowtie220 (version 2.3.0) tillåter inga missmatchningar. Skapa först ett index för filen med följande kommando:
bowtie2-bygga mature_name_of_the_organism_Mirs. FA mature_name_of_the_organism_Mirs - Justera sekvensering läsningar till databasen, kräver att en läsa kartor helt till en miRNA av databasen, utan några missmatchningar. Använd följande verktyg för detta ändamål:
bowtie2-N 0-L 10--Poäng-min C, 0, 0-slut-till-slutpunkt--Time-x mature_name_of_the_organism_Mirs-U Length_Filtered. fastq-S Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam
Anmärkning: alternativet:--Poäng-min C, 0,0 säkerställer att anpassningen är utan några missmatchningar. För en förklaring av de olika parametrarna i verktyget, gå till följande webbplats: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml - Om du vill ignorera läsningar som inte justeras använder du följande kommando:
samtools View-F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam > Reads_aligned_to_Mirs. Sam
Anmärkning: som ett resultat av dessa steg, bör du nu har fått de justerade läsningar, som motsvarar miRNAs.
- Ladda ner databasen som motsvarar organismen av studien från miRBase enligt följande. Gå till http://www.mirbase.org/ftp.shtml och ladda ner "mature. FA"-filen. Observera att sekvenserna anges i RNA-notation. Ersätt U-rester med T med följande kommando:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kritiska steg är isoleringen av den lilla RNA-fraktionen av det utgångs totala RNA-materialet (figur 3) och den önskade slutliga biblioteks produkten (figur 4). Båda stegen omfattar polyakrylamidgel rening; litet RNA isoleras från 15% TBE urea Gels, medan de slutliga biblioteken är isolerade från 6% inhemska TBE Gels. Litet RNA isolerat från gel kan analyseras på en liten RNA kapillär elektrofores chip (tabell över material; Figur 3 B). Detta gör det möjligt för användare att uppskatta mängden av det lilla RNA som återvinns och andelen Mirna i preparatet.
Gel rening av den slutliga biblioteks produkten är ett känsligt steg som ett antal ytterligare produkter bildas som migrerar nära det önskade biblioteket. Det är viktigt att inte överbelasta gelen eftersom detta kommer att öka risken för att kontaminera biblioteket med andra arter som adapterdimers. Som ett exempel (figur 4), laddades ökande mängder av PCR-förstärkt bibliotek (från B. napus RNA) på gelen och produkten motsvarade den förväntade storleken (150 BP) klipptes ut (figur 4A). Efter elueringen kontrollerades det renade biblioteket på ett kapillärgel elektrofores chip; Utöver den förväntade 150 BP-produkten sågs en ökande andel av en 130 BP-art, motsvarande adapterdimers, som ökade mängder PCR-produkt laddades (figur 4B, C).
Vi har testat om protokoll TS5 presterar på samma sätt med hemgjorda reagenser som med reagens från satserna. För detta ändamål utarbetade vi bibliotek från en blandning av syntetiska små RNAs 1-6, var och en närvarande utan eller med en 2 '-OMe modifiering, som gjort i vår tidigare studie12. Figur 5 visar hur stor andel av läsningar som motsvarar var och en av dessa rnas som erhållits tidigare och med de nya biblioteken som gjorts med reagenser från TS-och NF-paketen eller från andra leverantörer. Som kan ses, mycket liknande resultat erhölls.
Figur 6 visar en jämförelse av prestandan hos protokoll ts5 med standard TS-protokollet för detektion av växter (a. thaliana och B. napus) mirnas, som är 2 '-OMe modifierade, och av oförändrad mänsklig mirnas. Vi testade också upptäckten av piRNAs, 2 '-OMe modifierad i human prov. Som kan ses, presterar TS5 betydligt bättre än TS för detektion av 2 '-OMe RNAs men inte för oförändrad RNAs. Men även för oförändrade sRNAs, även om inte ett större antal RNAs upptäcks, de erhållna Läs numren förmodligen bättre återspegla sanna uttrycks nivåer med TS5 än med TS på grund av lägre nivåer av bias.
Figur 1 . Schematisk representation av sRNA library förberedelse arbetsflöde för Illumina sekvensering. Först, sRNAs isoleras av en gel reningssteg. Här indikeras storleksintervallet för miRNAs, men alla andra storleksintervall kan väljas, beroende på RNAs av intresse. Ett kvalitetskontroll (QC)-steg utförs sedan för att kontrollera kvaliteten och kvantiteten av isolerade sRNA. Under förberedelse av biblioteket, en preadenylated (app) 3 adapter är först och ligaturer till Srna. Sedan, en 5 ' adaptern är ligated. Därefter utförs omvänd Transkription med hjälp av en primer som kompletterar 3 ' adaptern, följt av PCR-förstärkning, under vilken Illumina P5, P7 och index (' in ') sekvenser läggs till. Det resulterande biblioteket är gel renas, följt av ett kvalitetskontroll steg. Sedan är biblioteket sekvenserade och data analyseras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Bias på grund av sekvens-beroende adapter-sRNA Co-vikning. I adaptern ligering blandningen, adaptrar kommer att cofold med srnas på ett sätt som beror på sekvensen av adaptern och Srna. Sålunda, olika sRNAs (illustrerad av exempel a, b, och c; indikeras av olika nyanser av grönt) kommer att cofold annorlunda med en given adapter (3 ' adaptern indikeras i rött, 5 ' adaptern indikeras i blått). De svarta pilarna indikerar ligationkorsningar. Detta kan leda till en gynnsam eller ofördelaktig kontext för ligering. Som RNL2 verkar föredra en dubbel Stranded miljö, 3 ' ligering förväntas vara mer effektiv för rnas a och b än för RNA c. Med RNL1 att ha en preferens för en enda strandad region runt ligering korsningen, 5 ' adapter ligering kan vara mest effektiva för RNA a, följt av b och minst effektiv för c. tillsammans kan detta resultera i en överrepresentation av Srna a, en intermediär representation av RNA b och en underrepresentation av RNA c i det slutliga biblioteket, även om de tre RNAs är närvarande vid lika belopp i det ursprungliga RNA-provet. Observera att på ett liknande sätt kommer en given sRNA att representeras på ett annat sätt när adaptersekvensen ändras (t. ex. genom att lägga till olika streckkoder). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Isolering av litet RNA och kvalitetskontroll. A) elektroforetisk separation av Brassica napus totalt RNA (10 μg) på en 15% TBE urea denaturerande polyakrylamidgel. En liten RNA-stege (se tabell över material) migrerades tillsammans som en molekyl storleks markör. Efter flyttningen färgas gelen och RNA visualiserades på en trans-illuminator. Regionen från 17 till 29 nukleotider klipptes ut (indikeras av en röd rektangel) och RNA eluerades. (B). kvaliteten på det renade RNA kontrollerades av kapillärgel elektrofores. Observera att denna analys ger information om andelen miRNA i provet (93% i detta fall). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Gel rening av ett B. napus litet RNA-bibliotek utarbetat efter protokoll ts5 och kvalitetskontroll. (A). ökande mängder av ett PCR-förstärkt bibliotek från B. napus litet RNA lastades på en 6% Native TBE gel; 2,5 μL (a), 5 μL (b), 10 μL (c) eller 20 μL (d) PCR-produkt. En 50 BP stege migrerades parallellt. PCR-produkter som migrerar vid förväntad 150 PB position isolerades (röd rektangel), DNA var eluerat och renat. B) kvalitetskontroll av det renade biblioteket. gel representation. C) elektropherogramframställning av samma analys. Som kan ses, den 150 PB produkten är alltmer förorenad med adapter dimerer (~ 130 BP) som större mängder av PCR-produkt migreras på gel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Protokoll TS5 utför på samma sätt med reagenser från TS-och NF-satserna eller med reagenser från andra leverantörer. Histogram som representerar den procentuella andelen av det totala antalet rå läsningar (före trimning) motsvarande RNA (OMe) 1-6 med protokoll ts5 följt med reagenser från TS-och NF-satserna (blå staplar), eller reagenser från andra leverantörer (orangefärgade staplar). För jämförelse visas resultaten från vår tidigare studie av gråa staplar. Det totala antalet läsningar motsvarande RNA1-6 (totaltRNA) eller RNA-OMe1-6 (totalt RNA-OMe) visas också. Visas är medelvärdena för minst två oberoende experiment. Felstaplar representerar standardavvikelser. En del av denna siffra har modifierats från dard-Dascot et al, 201812vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Jämförelse av miRNA upptäckt av protokoll TS5 med den klassiska TS-metoden. (A). andelen läsningar som kartlades till A. thaliana, B. napus eller H. sapiens mirnas i mirbase fastställdes. Vi kartlade också läsningar av mänskliga bibliotek till piRBase för piRNA upptäckt. Observera att A. thaliana och B. napus mirnas, liksom mänskliga pirnas är 2 '-OMe modifierad, i motsats till mänskliga mirnas. Visas är medelvärdena för minst två oberoende experiment och felstaplar representerar standardavvikelser. (B). antal mirnas (eller pirnas) identifierade. Vi bestämde antalet kända miRNAs från de olika arter som identifierats med protokollen TS eller TS5. Observera att för A. thaliana, B. napus, eller H. sapiens, 427, 92, och 2588 mirnas har registrerats i mirbase, respektive. 500 000 läsningar från TS-eller TS5-biblioteken mappades till B. napus mirnas i mirbase, 1 000 000 läsningar har mappats till A. thaliana -eller Human-databaserna. Visas är medelvärdena för minst två oberoende experiment med standardavvikelser som representeras av felstaplar. Denna siffra har modifierats från dard-Dascot et al, 201812. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn oligonukleotid | 5 "ändring | 3 "ändring | sekvens 5 ' till 3 ' | Rening | |||||
| 5-adapter för HD (TS5) | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNrNrNrN (Observera att detta oligo är ett DNA-RNA chimeric; de tre 3 ' Terminal NTS är RNA) | Hplc | ||||||
| 3 ' HD (TS5)-adapter | Fosfat | 3AmMO | [Phos] rNrNrNrNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG [3AaMO] (Observera att detta oligo är ett DNA-RNA chimeric; de fyra 5 ' Terminal NTS är RNA) | Hplc | |||||
| 5-adapter för MRL-värde (TS7) | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNNNNrArCrGrArUrArC (Observera att detta oligo är ett DNA-RNA chimeric; de sju 3 ' Terminal NTS är RNA) | Hplc | ||||||
| 3-adapter för MRL-värde (TS7) | Hydro | 3AmMO | Phos The GTATCGTNNNNNNTGGAATTCTCGG [3AmMO] | Hplc | |||||
| RT primer | GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA | Hplc | |||||||
| Universal P5 primer | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA | Hplc | |||||||
| P7-index primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA (NNNNNN = index) | Hplc | |||||||
| index 1: CGTGAT | |||||||||
| index 2: ACATCG | |||||||||
| index 3: GCCTAA | |||||||||
| index 4: TGGTCA | |||||||||
| index 5: CACTGT | |||||||||
| index 6: ATTGGC | |||||||||
| index 7: GATCTG | |||||||||
| index 8: TCAAGT | |||||||||
| index 9: CTGATC | |||||||||
| index 10: AAGCTA | |||||||||
| index 11: GTAGCC | |||||||||
| index 12: TACAAG | |||||||||
Tabell 1. Oligonukleotides som används med detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Små RNA-biblioteksförberedelser fortsätter att vara utmanande på grund av bias, främst under adapterligations steg. RNAs med en 2 '-OMe modifiering vid deras 3 ' slutet såsom växt miRNAs, piRNA i insekter, nematoder och däggdjur, och små störande RNAs (siRNA) i insekter och växter är särskilt svåra att studera eftersom 2 '-OMe modifiering hämmar 3 ' adapter ligering. Ett antal lösningar har föreslagits i litteraturen för att förbättra sRNA bibliotek förberedelse protokoll, men de flesta kommersiellt tillgängliga kit är fortfarande baserade på den klassiska TS-protokollet, som har svår bias. Några "låg bias" kit finns dock, inklusive NF kit med randomiserade adaptrar och PEG i ligering reaktionerna, och några kit verkade nyligen att undvika adapter ligering helt12. Vi rapporterade tidigare att NF upptäcker mer olika miRNAs än standard TS-protokollet, men protokollets ' (utan adapter ligation) utförs relativt dåligt på grund av en betydande bildandet av Side-produkter12. Överraskande nog, vid modifiering av TS-protokollen hade en känsligare detektering av 2 '-OMe sRNAs än de andra protokollen, men inte av normal sRNAs. Vi valde här för att beskriva i detalj TS5 protokollet, där adaptrarna är randomiserade i sina extremiteter, PEG används i ligering reaktioner och överskott 3 ' adaptern elimineras genom rening på pärlor. Det bör noteras att ett annat protokoll (TS7), med hjälp av MRL-adaptrar, kan prestera något bättre än TS5-protokollet. Men eftersom det bara finns mindre skillnader mellan de två och eftersom med TS7, är det svårare att separera önskad biblioteks produkt från adapter dimers, föredrog vi här för att beskriva i detalj TS5 protokollet. Användarna kan dock, om så önskas, ersätta TS5-adaptrarna med TS7-adaptrar. Observera att dessa är något längre leder till en slutlig biblioteks produkt av ~ 170 BP snarare än ~ 150 BP.
Möjligheten att utföra protokoll TS5 eller TS7 med "Hemgjort" material gör det möjligt att avsevärt minska kostnaderna. Det kan dock finnas en större variation i fråga om kvalitet med hemgjorda material; särskilt hemlagad pre-adenylerad 3-adapter kan vara föremål för varierande kvalitet på grund av varierande effektivitet av pre-adenylering. Det rekommenderas därför att förbereda ett stort lager och om ett nytt lager förbereds, jämföra dess prestanda med den tidigare. Ett kontroll-RNA-prov kan användas för detta ändamål.
En nackdel med protokollen beskriver häri är den relativt starka bildandet av sidoprodukter och svårigheten att separera önskat bibliotek från dessa produkter. Försiktighet måste iakttas för att inte överbelasta akrylamidgelen för rening. Nyligen utvecklades modifierade adaptrar som har en starkt reducerad tendens att bilda dimerer21. En 2 '-OMe modifiering vid 3 ' änden av 5 ' adaptern kombinerat med en metylfosfonat modifiering vid 5 ' extremiteten av 3 ' adaptern effektivt undertryckta adapter dimers. Det kommer att bli intressant att testa sådana modifierade adaptrar i häri beskrivna protokollet.
Gel reningsstegen i protokoll TS5 är relativt arbetsintensiva. Om användningen av modifierade adaptrar effektivt minskar bildandet av adapter dimers, gel rening av det slutliga biblioteket kanske inte nödvändigt längre. Dessutom, som ett alternativ till gel rening steg för att isolera små RNA (steg 1), en strategi med hjälp av magnetiska pärlor för att berika för små RNAs existerar (https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf). Vi har inte använt denna metod själva, men det är värt att testa och om det fungerar bra kan det avsevärt förenkla protokollet.
Sammanfattningsvis, medan protokoll TS5 skulle kunna förbättras ytterligare, det presterar bättre än kommersiellt tillgängliga kit, åtminstone de testade i vår tidigare jämförande analys, för detektion av 2 ' OMe sRNA. Det kan följas med hjälp av hemgjorda material, vilket möjliggör betydande kostnadsreduktion. För enkelhetens skull, och kanske mer konstant prestanda, kan reagenser från TS-och NF-satserna användas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av nationella centrum för vetenskaplig forskning (CNRS), den franska alternativa energier och atomenergikommissionen (CEA) och Paris-Sud University. Alla bibliotek beredning, Illumina sekvensering och bioinformatik analyser för denna studie utfördes vid I2BC Next-generation sekvensering (NGS) anläggning. Medlemmarna i I2BC NGS anläggningen är erkända för kritisk läsning av manuskriptet och användbara förslag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes | |||
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
