Summary
我们提出了详细的小RNA库修复协议，比标准方法的偏差小，对2'-O-甲基RNA的灵敏度提高。使用自制试剂可节省成本或使用试剂盒以方便使用本协议。
Abstract
下一代测序（NGS）对小型RNA（sRNA）的研究在库制备过程中受到偏置问题的挑战。几种类型的sRNA，如植物微RNA（miRNA）在其3'端核苷酸下进行2'-O-甲基（2'-OMe）修饰。此修改增加了另一个困难，因为它禁止 3' 适配器连接。我们之前已经证明，修改版的"TruSeq （TS）"协议具有较少的偏差，并改进了对 2'-OMe RNA 的检测。在这里，我们详细介绍了协议"TS5"，它显示了最佳的整体性能。TS5 可采用自制试剂或 TS 试剂盒中的试剂，性能相同。
Introduction
小型RNA（sRNA）参与控制生物过程的多样性1。真核子病监管sRNA的大小一般在20至30NT之间;三种主要类型是微RNA（miRNA）、piwi相互作用RNA（piRNA）和小型干扰RNA（siRNA）。异常miRNA表达水平已牵连于各种疾病2。这强调了miRNA在健康和疾病中的重要性，以及准确、定量的研究工具来检测一般sRNA的要求。
下一代测序（NGS）是研究sRNA的一种广泛应用的方法。与其他方法（如定量PCR或微阵列技术（qPCR）相比，NGS的主要优点是，它不需要先验的sRNA序列知识，因此可用于发现新的RNA，此外，它遭受的较少背景信号和饱和度效应。此外，它可以检测单个核苷酸差异，并且具有比微阵列更高的吞吐量。然而，NGS也有一些缺点;测序运行的成本仍然相对较高，将样本转换为库进行测序所需的多步骤过程可能会引入偏差。在典型的sRNA库制备过程中，在没有ATP的情况下，使用截断版本的RNA连带酶2（RNL2）和预分3'适配器（图1），首先将3'适配器与sRNA（通常是从总RNA中凝胶纯化）连结。这提高了sRNA适配器结扎的效率，并减少了侧反应的形成，如sRNA循环或串联。随后，5' 适配器由RNA连带1（RNL1）连接，然后是逆转录（RT）和PCR扩增。所有这些步骤都可能引入偏差3，4。因此，读取数可能无法反映导致人工的、依赖于方法的表达模式的实际 sRNA 表达水平。特定 sRNA 在库中可能过多或不足，且代表性严重不足的 sRNA 可能逃脱检测。情况特别复杂，植物miRNA，昆虫和植物的siRNA，以及昆虫、线虫和哺乳动物中的piRNA，其中3'端核苷酸具有2'-O-甲基（2'-OMe）修饰1。这种修改强烈抑制了3'适配器结扎5，使得为这些类型的RNA准备库准备是一项艰巨的任务。
以前的工作表明，适配器结扎引入严重的偏差，由于RNA序列/结构效应6，7，8，9，10，11。适配器结扎的下游步骤（如逆转录和 PCR）不会显著导致偏差6、11、12。结扎偏差可能是由于具有给定序列的适配器分子与反应混合物中的 sRNA 分子相互作用，形成共褶，这可能导致连接的有利或不利配置（图 2）。来自Sorefan等人7的数据表明，RNL1更喜欢单一搁浅的语境，而RNL2则更喜欢双绞线进行结扎。适配器/sRNA 共折叠结构由特定的适配器和 sRNA 序列决定这一事实解释了为什么特定 sRNA 在给定适配器集中过度表示或表示不足。还必须注意，在要比较的一系列 sRNA 库中，应使用相同的适配器序列。事实上，以前已经观察到，通过引入不同的条形码序列来改变适配器会改变测序库中的miRNA配置文件9，13。
在结扎结附近随机化适配器序列可能会减少这些偏差。Sorefan 和同事7使用四肢有 4 个随机核苷酸的适配器，指定"高清晰度"（HD） 适配器，并表明使用这些适配器可产生更好地反映真实 sRNA 表达水平的库。最近的工作证实了这些观察结果，并表明随机区域不需要与结扎交汇点11相邻。这种新型适配器被命名为"MidRand"适配器。总之，这些结果表明，改进的适配器设计可以减少偏差。
通过优化反应条件，可以抑制偏置，而不是修改适配器。聚乙烯乙二醇（PEG），一种大分子挤出剂，已知能提高结扎效率14，已被证明能显著减少偏置15，16。根据这些结果，市场上出现了几个"低偏置"套件。其中包括在连接反应中使用 PEG 的套件，包括与经典适配器或 HD 适配器结合使用。其他套件完全避免结扎，并使用3'聚化和模板切换3'和5'适配器添加，分别12。在另一种策略中，3' 适配器连接后跟一个循环步骤，因此省略了 5' 适配器连接17。
在以前的研究中，我们搜索了一个sRNA库准备协议，其偏差程度尽可能低，并且对2'-OMe RNA12的最佳检测值。我们测试了上述一些"低偏置"试剂盒，与标准协议 （TS） 相比，对 2'-OMe RNA 的检测效果更好。然而，令人惊讶的是，在修改（使用随机适配器，PEG在结扎反应和去除多余的3'适配器通过纯化）后，后者优于其他协议检测2'-OMeRNA。在这里，我们详细介绍了基于 TS 协议的协议"TS5"，该协议对 2'-OMe RNA 进行了全面检测最好）。该协议可以使用TS试剂盒中的试剂和"Nf"试剂盒中的一种试剂进行遵循，或者为了节省资金，使用自制的试剂，性能相同。我们还提供了从总RNA中纯化sRNA和制备预化3'适配器的详细方案。
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Protocol
1. 隔离小RNA
- 使用基于苯酚的试剂或任何其他方法提取总RNA。验证RNA是否质量良好。
- 在200V下预运行15%TBE尿素凝胶（见材料表）15分钟。
- 当凝胶预运行时，在200μL PCR管中，将5-20μg的总RNA与同等体积的成酰胺加载染料（见材料表;95%去离子化形式酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯甲醇、5mM EDTA pH 8）混合。同样，将10μL（200 ng）的小RNA阶梯（见材料表）与相同体积的成酰胺加载染料混合。在65°C下用加热盖的热循环器孵育5分钟，然后将管子立即放在冰上。
- 将梯子和样品装入同一凝胶上，至少使用一条车道，以 200 V 的速度运行，直到溴酚蓝（深蓝色）迁移了大约三分之二的凝胶长度（约 40 分钟）。
- 准备一个系统，从凝胶中洗出RNA：用21号针刺穿无核酸酶0.5 mL微型离心管的底部。将刺穿的 0.5 mL 管放入无核酸酶的圆底 2 mL 微型离心管中。
- 取出凝胶，在室温下用3μL核酸凝胶染色（10，000 x浓缩物;见材料表）在30 mL水中孵育10-15分钟。
- 查看"黑暗阅读器"转照器上的凝胶（强烈建议避免紫外线，因为这可能会损坏 RNA），并切掉 17 nt 和 29 nt 梯形带之间的样本 RNA。将凝胶片从步骤 1.5 转移到 0.5 mL 管。
- 在微型离心机中以最大速度将 2 mL 管中的 0.5 mL 管离心 2 分钟。取出 0.5 mL 管，该管现在应该是空的。
- 将300 μL无核酸酶0.3 M NaCl加入含有碎凝胶的2 mL管中，在室温或4°C过夜（16小时）时至少旋转2小时。
- 将碎凝胶片的悬浮液转移到旋转柱（见材料表）和离心机，在微型离心机中以最高速度旋转2分钟。
- 加入1μL（20微克/μL）的糖原（见材料表）和950μL室温100%乙醇。在-80°C下孵育至少30分钟。
- 在4°C的微型离心机中以最高速度离心20分钟。去除上清液，用800 μL的冷80%乙醇清洗颗粒。在4°C下再次离心5分钟，并小心地去除所有上清液。在15μL的无核酸酶水中重新悬浮RNA颗粒。通常，应根据输入总RNA的量（每1μg输入总RNA的1个最小RNA）应恢复±5-20 ng的小RNA。
- 建议的附加步骤：检查回收的sRNA的数量和质量（例如，使用小型RNA试剂盒进行毛细血管凝胶电泳;参见材料表）。
2. 准备预置 3' HD 适配器
注：3' HD适配器的预置方式与陈等人18日描述的协议类似。请注意，预授权适配器可以直接订购（/5rApp/修改），但这是相当昂贵的。
- 订单 5' 磷酸化，3' 阻塞 3' HD 适配器寡核苷酸。有关顺序和修改，请参阅表 1。请注意，"3AmMO"是一个3'氨基酸修饰剂组，大多数供应商可以生产寡核苷酸与这种修改。在无核酸酶水中稀释至100μM。
- 建立含有以下试剂的100μL反应：10μL的寡聚糖（100μM），10μL的T4RNA胶质缓冲液（10x），10μL的ATP（10mM），40μL的50%PEG80000，5μL的T4RNA胶质1（50个单位），25μL的无核酸酶水。在20°C下孵育过夜。
- 对预增化寡核苷酸进行经典苯酚-氯仿提取，然后进行乙醇沉淀。加入100μL酸（pH 4.5）酚：氯仿和涡旋。在室温下旋转 5 分钟，最高速度。小心地将上相的90μL转移到新管中;加入10μL的3M醋酸钠pH 5.2，1μL的超纯糖原和250μL的冷100%乙醇。
- 保持-20°C至少30分钟，在4°C最大转速下离心30分钟。去除上清液，用500μL冷80%乙醇清洗颗粒一次。作为苯酚氯仿提取和乙醇沉淀的替代品，可以使用核苷酸去除试剂盒（见材料表）。在25μL水中重新悬浮。
- 使用试剂盒测量适配器的浓度，用于特定检测单链DNA（参见材料表）。稀释至80纳克/μL（10 μM）。
- 建议的附加步骤：通过在15%TBE尿素凝胶（材料表）上迁移1μL的10μM适配器以及未经处理的寡核苷酸，验证预糖的功效。预分适配器的迁移速度应略低于未经处理的寡核苷酸。如果需要，预显化适配器可以凝胶纯化;按照上述步骤继续（步骤 1.2-1.12）。
3. 库准备 - TS5 议定书
注：我们在此介绍我们前面描述的经过改进的 TS 协议"TS5"，可以使用试剂盒中的试剂或自备试剂执行。应该注意的是，我们使用不同的协议"TS7"获得了类似甚至稍微好的结果。但是，使用 TS7 时，要消除适配器二聚器更加困难。因此，我们更愿意详细描述 TS5，但 TS7 之后只需更换适配器即可。对于 TS7，请使用"中线状 （MRL）"适配器序列 （表 1）。请注意，此处的随机区域位于适配器的中间。反向转录和 PCR 的引信将混合到 3' 适配器中随机区域下游的序列和 5' 适配器中随机区域的上游。测序将从 5' 适配器中的第一个随机核苷酸开始。
- 3' 适配器连接。
- 在 0.2 mL 微型离心管中结合 1 μL 的预分 3' HD 适配器 （10 μM） 与 1 μL 纯化小 RNA （±0.1-1 μM）。在72°C的热循环器中孵育2分钟，然后直接放在冰上。
- 加入4μL的50%PEG 8000（粘性溶液;移液缓慢），1μL的RNA胶合缓冲液（10x），1μL的H2O，1μL的T4RNA连体酶2截断，和1μL的RNase抑制剂。在16°C下孵育过夜。
- 消除未加联的 3' 适配器
- 加入10μL的无核酸酶水，混合均匀。从 Nf 套件（材料表）中加入 6 μL 的 3 M NaOAc pH 5.2 或"适配器耗尽溶液"，并混合均匀。加入40μL的磁性纯化珠（材料表）和60μL异丙醇，搅拌均匀。在室温下孵育5分钟。
- 将样品放入磁性机架中，直到溶液看起来清晰。拆下并丢弃上清液。
- 加入180 μL新鲜制备的80%乙醇。孵育30s，然后取出。小心使用新鲜制备的80%乙醇，不要长时间用80%乙醇孵育。
- 短暂旋转管并清除可能聚集在井底的残余液体。让珠子干燥 2 分钟，然后在 22 μL 的 10 mM Tris pH 8 或从 Nf 套件中重新悬浮缓冲液中重新悬浮。孵育2分钟，然后磁化样品，直到溶液看起来清晰。
- 将 Nf 套件（材料表）中的 6 μL 3 M NaOAc pH 5.2 或"适配器耗尽溶液"添加到新管中。将上一步的20μL上清液转移到新管，并通过移液混合。加入40μL的磁珠和60μL的100%异丙醇，并通过移液很好地混合。孵育5分钟。
- 将样品磁化，直到溶液清晰，然后取出并丢弃上清液。
- 加入180 μL新鲜制备的80%乙醇。孵育30s，然后取出。使用新鲜制备的80%乙醇，不要长时间用80%乙醇孵育。
- 短暂旋转管并清除可能聚集在井底的残余液体。让珠子干燥2分钟，在10μL无核酸酶水中重新悬浮。孵育2分钟，然后磁化样品，直到溶液看起来清晰。
- 将 9 μL 的上清液转移到新管中。加入1μL的T4RNA连结酶缓冲液（10x）和1μL的水。或者，从 TS 试剂盒中添加 2 μL 的连数缓冲液。
- 5' 适配器的结扎。
- 添加 1 μL 的 5' HD 适配器 （10 μM;表 1）在带加热盖的热循环器中，至 200 μL PCR 管。在70°C下孵育2分钟，然后将管子直接放在冰上。
- 加入1μL的10mM ATP和1μL的T4RNA利加酶1。轻轻移液，将混合均匀。从步骤 3.2.9 将 3 μL 的这种混合物添加到 3' 连体 RNA 中，并通过移液混合。在28°C下孵育1小时。
- 反向转录 （RT）
- 将 6 μL 的 3' 和 5' 适配器连结 RNA 转移到新的 200 μL PCR 管中（将剩余的 ±8 μL 保持在-80°C，以便以后使用（ 如有必要）。加入1μL的RT底漆（10μM;表 1）并通过移液混合。在70°C下孵育2分钟，然后将管子直接放在冰上。
- 为RT添加以下试剂：2 μL的5x第一股缓冲液，0.5 μL的12.5 mM dNTP混合物，1μL的100mM DTT，1μL的RN酶抑制剂，和1μL的逆转录酶（材料表）。在50°C下孵育1小时。
- PCR 扩增
- 将以下试剂加入12.5 μL的RT反应混合物中：10μL PCR聚合酶缓冲液，2μL的通用P5引物（10μM;表1），P7-index引漆2μL（10 μM;表1），1μL的12.5 mM dNTPs，0.5 μL的DNA聚合酶（材料表），和22μL的水。保持在冰上的反应，直到使用。
- 运行以下 PCR 程序：98 °C 30 s，11 个周期（98 °C 10 秒，60 °C 30 秒，72°C 15 秒）和 72°C 10 分钟。
注：关于PCR周期的数量：我们通常执行11个周期，但这应该由用户进行优化。尝试执行尽可能少的 PCR 周期。
- 凝胶纯化
- 在原生 6% TBE 凝胶（参见材料表）上运行 5、10 和 20 μL PCR 产品以及合适的梯子（参见材料表）。在145 V下运行凝胶约1小时（直到溴酚蓝色到达底部;这种染料在65 bp位置迁移）。
- 取出凝胶，用核酸凝胶染色（见材料表）在水中孵育10-15分钟。
- 查看"黑暗阅读器"转照器上的凝胶（强烈建议避免紫外线，因为这可能会损坏RNA），并在150 bp处切出库带。
- 在微型离心机中以最大速度离心2分钟，取出0.5 mL管，该管现在应该是空的。
- 将300 μL无核酸酶水加入含有粉碎凝胶的2 mL管中，在室温下或在4°C下旋转至少2小时过夜。
- 将水中碎凝胶片的悬浮液转移到旋转柱和离心机，以最大速度旋转 2 分钟。
- 加入1 μL（20 μg/μL）糖原，30μL 3M NaOAc和975 μL冰冷100%乙醇。在 4°C 下以最大速度离心 20 分钟。
- 在 20 μL 的 10 mM Tris pH8 中重新悬浮颗粒。使用 1 μL 进行浓度测量，使用 1 μL 进行质量控制。
4. 数据分析
注：下面描述的数据分析过程基于 Linux 操作系统 Ubuntu 16.04 LTS。
- 原始序列文件的处理
- 下载排序运行期间生成的 FASTQ 序列文件。如果需要，使用 bcl2fastq2（版本 V2.2.18.12;可从以下链接下载手册）：http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html）执行去复用。
使用以下命令：
nohup Pathway_bcl2fastq/bcl2fastq -runfolder-dir路径_运行--忽略缺失-bcl -输出-dir路径_输出_目录--条形码-不匹配 1 -- 聚合切片 AUTO-r 16-d 16-p 16-p 16-w 16-w 16 - 使用 Cutadapt19版本 1.15 删除适配器序列。手册可在此处下载：https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html。
使用以下命令：
路径_到-切割适应/切割适应 - a TGGAATTCTCGGGGGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10-j 0 --下一个seq-修剪 10 -o输出_文件_读取1_切割适应.fastq.gz输入_文件_读取1.fastq.gz
请注意，命令中的序列对应于没有4 个随机核苷酸的 3' HD 适配器;因此，在此步骤中不会删除这些。 - 使用seqtk（https://github.com/lh3/seqtk）去除测序读取中的终端随机核苷酸。使用以下命令（以粗体显示的变量名称）：
seqtk trimfq -b 4 -e 4输出_文件_读取1_切割适应.fastq >输出_文件_读取1*修剪.fastq - 使用以下 awk 命令可丢弃短于 10 nt 的序列：
awk 'BEGIN _FS = "\t";OFS = "\n"= [标头 = $0; getline qq; getline qseq; 如果 （长度 （seq） > = 10） [打印头， seq， qqq] 输出_文件 _读取 1_已修剪.fastq > 长度__已筛选.fastq
- 下载排序运行期间生成的 FASTQ 序列文件。如果需要，使用 bcl2fastq2（版本 V2.2.18.12;可从以下链接下载手册）：http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html）执行去复用。
- 修剪序列的映射
- 下载与研究生物的数据库对应的数据库，如下所示。转到http://www.mirbase.org/ftp.shtml并下载"mature.fa"文件。请注意，序列在RNA表示法中指示。使用以下命令将 U 残差替换为 T：
sed -i '/\gt;/！s/U/T/g' 成熟。
注：这将产生来自各种生物体的所有miRNA的完整列表。 - 使用以下命令选择您感兴趣的生物体的 miRNA 序列：
awk '名称]的[组织]打印;nr_NR_1;下一个];NR 在 nr' 成熟.fa > 成熟 _名称 __有机体_mirs.fa - 使用 Bowtie220（版本 2.3.0）将读取映射到上述创建的文件，不允许不匹配。首先，使用以下命令为文件生成索引：
鲍蒂2-建立成熟_名称[生物]米尔斯.fa成熟_名称[生物]米尔 - 将排序读取与数据库对齐，要求读取完全映射到数据库的 miRNA，没有任何不匹配。为此，请使用以下工具：
bowtie2 -N 0 -L 10 --分数-分钟 C，0 --端到端 -时间 -x 成熟_名称 __有机体_mirs -U长度_过滤.fastq -S长度_筛选_协调.sam
注： 选项： --分数最小 C，0，0 可确保对齐方式没有任何不匹配。有关该工具中各种参数的说明，请访问以下网站：http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml - 要放弃未对齐的读取，请使用以下命令：
samtools 视图 -F 4长度_已筛选_对齐.sam >读取_对齐_到_Mirs.sam
注： 由于这些步骤，您现在应该已经获得了与 miRNA 对应的对齐读取。
- 下载与研究生物的数据库对应的数据库，如下所示。转到http://www.mirbase.org/ftp.shtml并下载"mature.fa"文件。请注意，序列在RNA表示法中指示。使用以下命令将 U 残差替换为 T：
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Representative Results
关键步骤是分离起始总RNA材料的少量RNA部分（图3）和所需的最终库产物（图4）。这两个步骤都涉及聚丙烯酰胺凝胶纯化;小RNA从15%TBE尿素凝胶中分离，而最终库从6%原生TBE凝胶中分离。从凝胶中分离出的小RNA可以在小RNA毛细管电泳片上进行分析（材料表;图 3B）这将允许用户估计小RNA的回收量和miRNA在制备中的比例。
最终库产品的凝胶纯化是一个微妙的步骤，因为许多额外的产品被形成，迁移到附近的所需库。重要的是不要超载凝胶，因为这将增加污染库与其他物种，如适配器二丁器的风险。例如（图4），在凝胶上加载了越来越多的PCR扩增库（来自B.napus RNA），并切除了与预期尺寸（150 bp）相对应的产品（图4A）。洗脱后，在毛细管凝胶电泳片上检查纯化库;除了预期的150 bp产品外，随着PCR产品数量的增加，观察到与适配器调暗器相对应的130 bp种中所占比例增加（图4B，C）。
我们已经测试了协议TS5与试剂盒中试剂的性能是否相同。为此，我们准备了来自合成小RNA 1-6 混合的库，每个库没有或带有 2'-OMe 修改，正如我们以前的研究12所做的那样。图 5显示了与以前获得的每个 RNA 以及使用 TS 和 Nf 试剂盒或其他供应商的试剂制成的新库对应的读取比例。可以看出，结果非常相似。
图6显示了协议TS5与标准TS协议的性能的比较，用于检测经过2'-OMe修改的植物（A.thaliana和B.napus）miRNA和未经修改的人类miRNA。我们还测试了在人类样本中经过修饰的piRNA，2'-OMe的检测。可以看出，TS5 在检测 2' OMe RNA 时的性能明显优于 TS，但不适用于未修改的 RNA。然而，对于未修改的sRNA，即使检测不到更多的RNA，获得的读取数可能更好地反映TS5的真实表达水平，而不是TS，因为偏差水平较低。
图 1.用于Illumina测序的sRNA库制备工作流程的原理表示。首先，sRNA通过凝胶纯化步骤进行分离。此处，指示 miRNA 的大小范围，但可根据感兴趣的 RNA 选择任何其他大小范围。然后执行质量控制 （QC） 步骤，以检查隔离 sRNA 的质量和数量。在库准备期间，预处理 （App） 3' 适配器首先与 sRNA 连接。然后，将连接 5' 适配器。随后使用补充 3' 适配器的底漆进行逆转录，然后是 PCR 扩增，在此期间，将添加 Illumina P5、P7 和索引 （"In"） 序列。生成的库经过凝胶纯化，然后是质量控制步骤。然后对库进行排序，并分析数据。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.由于序列依赖的适配器-sRNA 共折叠而产生偏差。在适配器连接混合物中，适配器将依适配器和 sRNA 的顺序与 sRNA 共同折叠。因此，不同的 sRNA（由示例 a、b 和 c 表示;由不同的绿色阴影表示）将与给定适配器以不同的方式折叠（3' 适配器以红色表示，5' 适配器以蓝色表示）。黑色箭头表示结扎结点。这可能导致连接有利或不利的环境。由于RNL2似乎更喜欢双重搁浅环境，3' 结扎预计RNA a和b比RNA c更有效。由于 RNL1 在结扎结周围具有单个绞合区域的偏好，因此 5' 适配器结扎对 RNA a 可能最为有效，其次是 b 和最低效率 c。RNA b 的表示和最终库中 RNA c 的代表性不足，即使原始 RNA 样本中三个 RNA 以相同量存在。请注意，以类似的方式，在更改适配器序列时（例如，通过添加不同的条形码）时，给定的 sRNA 表示方式会有所不同。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.分离小RNA和质量控制。（A）.在15%TBE尿素变性聚丙烯酰胺凝胶上，对布拉西卡纳普斯总RNA（10μg）进行电泳分离。一个小的RNA阶梯（见材料表）作为分子大小标记迁移。迁移后，凝胶被染色，RNA在转照器上可视化。从17到29个核苷酸的区域被切掉（用红色矩形表示），RNA被洗脱。（B）通过毛细管凝胶电泳检查纯化RNA的质量。请注意，此分析提供有关样本中 miRNA 比例的信息（本例中为 93%）。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.根据TS5协议和质量控制制备的B.napus小RNA库的凝胶纯化。（A）.从B. napus小RNA中增加的 PCR 扩增量被加载到 6% 的原生 TBE 凝胶上;2.5 μL （a）， 5 μL （b）， 10 μL （c） 或 20 μL （d） PCR 产品。一个50bp的梯子被迁移在一起。在预期150pb位置迁移的PCR产物被分离（红色矩形），脱氧核糖核酸被洗脱和纯化。（B）净化库的质量控制;凝胶表示。（C）.同一分析的电象图表示。可以看出，随着大量 PCR 产物在凝胶上迁移，150 pb 产品越来越多地受到适配器二聚子 （±130 bp） 的污染。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5.协议 TS5 与 TS 和 Nf 试剂盒的试剂或其他供应商的试剂执行类似。直方图表示与RNA（OMe）1-6对应的原料读取（修剪前）总数百分比，协议TS5随后为TS和Nf试剂盒（蓝条）的试剂，或来自其他供应商的试剂（橙色条）。为了进行比较，我们以前研究的结果以灰色条显示。显示与RNA1-6（总RNA）或RNA-OMe1-6（总RNA-OMe）对应的读取总数。所示为至少两个独立实验的平均值。误差条表示标准偏差。此图的一部分已由 Dard-Dascot 等人修改，201812请点击这里查看此图的较大版本。
图 6.方案TS5的miRNA检测与经典TS方法的比较。（A）确定了在 miRBase 中映射到A. thaliana、B. napus或H. saiens miRNA 的读取比例。我们还将人类库的读取映射到 piRNA 检测 piRBase。请注意，A.thaliana和B.napus miRNA 以及人类 piRNA 都经过 2'-OMe 修饰，与人类 miRNA 相比。图中所示为至少两个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。（B.识别的 miRNA （或 piRNA） 数量。我们确定了与TS或TS5协议所识别的不同物种的已知miRNA的数量。请注意，对于A. thaliana、 B. napus 或 H. saiens，427、92和 2588 miRNA 分别在 miRBase 中注册。TS 或 TS5 库中的 50 万次读取被映射到 miRbase 中的B. napus miRNA，100 万次读取映射到A. thaliana或人类数据库。图中所示为至少两个独立实验的平均值，这些实验的标准偏差由误差条表示。这个数字已由Dard-Dascot等人修改，2018年12。请点击此处查看此图的较大版本。
| 名称 寡核苷酸 | 5' 修改 | 3' 修改 | 序列 5' 到 3' | 净化 | |||||
| 5' HD （TS5） 适配器 | 5AmMC6 | [5AmMC6]GTTCAGAGCTCTCTCTCCCGATCNrN（请注意，这种寡核苷酸是DNA-RNA嵌合物;三个3'端点是RNA） | HPLC | ||||||
| 3' HD （TS5） 适配器 | 磷 | 3AmMO | [磷的nrnrnNTGGATATTGGTGGCCAGG[3AAMO]（请注意，这种寡核苷酸是DNA-RNA嵌合物;四个5'端点是RNA） | HPLC | |||||
| 5' MRL （TS7） 适配器 | 5AmMC6 | [5AmMC6]GTTCAGAGCTCTCTCTCTCGATCNNNArCrararArArC（请注意，这种寡果是DNA-RNA嵌合物;七个3'端点是RNA） | HPLC | ||||||
| 3' MRL （TS7） 适配器 | 福斯普 | 3AmMO | [磷]GTATCGTNNNNNATATTCTCGG[3AmMO] | HPLC | |||||
| RT 引水器 | 海合会CCCCAGAGAATCCA | HPLC | |||||||
| 通用 P5 引种 | AATGATACATACACCACCACCATATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT | HPLC | |||||||
| P7 索引引种 | CAAGAGAGAGAGATATATATATNNATATATATGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCATATATCACCATATCAA（NNNN= 指数） | HPLC | |||||||
| 索引1：CGTGAT | |||||||||
| 索引 2：ACATCG | |||||||||
| 索引3：GCCTAA | |||||||||
| 索引4：TGGTCA | |||||||||
| 索引5：CACTGT | |||||||||
| 索引6：ATTGGC | |||||||||
| 索引7：《反恐条约》 | |||||||||
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表 1.该协议中使用的寡核苷酸。
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Discussion
由于偏置，小RNA库制备仍然具有挑战性，主要在适配器连接步骤中引入。在3'末端进行2'-OMe修饰的RNA，如植物miRNA、昆虫、线虫和哺乳动物中的piRNA，以及昆虫和植物中的小型干扰RNA（siRNA），尤其难以研究，因为2'-OMe修饰会抑制3'适配器结扎。文献中提出了一些解决方案来改进sRNA库准备协议，但大多数市售试剂盒仍然基于传统的TS协议，它有严重的偏差。然而，有几个"低偏置"套件存在，包括带有随机适配器的Nf套件和连接反应中的PEG，最近出现了一些完全避免适配器结扎的套件。我们之前报告说，Nf检测到的miRNA比标准TS协议更不同，但协议'S'（没有适配器连接）执行相对较差，因为侧产物12的形成显著。令人惊讶的是，在修改时，TS 协议对 2'-OMe sRNA 的检测比其他协议更灵敏，但非正常 sRNA 检测。我们选择在这里详细描述 TS5 协议，其中适配器在其四肢随机化，PEG 用于结扎反应，多余的 3' 适配器通过在珠子上纯化消除。这里应该注意的是，使用 MRL 适配器的不同协议 （TS7） 的性能可能略好于 TS5 协议。但是，由于二者之间只有细微的差别，并且对于 TS7，将所需的库产品与适配器二聚器分开比较困难，因此我们最好在此处详细描述 TS5 协议。但是，如果需要，用户可以用 TS7 适配器替换 TS5 适配器。请注意，这些部分稍长一些，最终库积为 ±170 bp，而不是 ±150 bp。
使用"自制"材料执行 TS5 或 TS7 协议的可能性可大幅降低成本。然而，在质量方面，国产材料可能存在较大的差异;特别是国产预发3'适配器可能会受到可变质量的影响，由于预验证的不同效力。因此，建议准备一个大型股票，如果准备一个新的股票，比较其业绩与前一个。控制RNA样本可用于此目的。
此处描述的协议的一个缺点是侧产品的形成相对强大，并且难以将所需的库与这些产品分开。必须注意不要使丙烯酰胺凝胶过载以进行纯化。最近，改进的适配器被开发，有一个强烈减少的倾向，形成二聚体21。5' 适配器 3' 端处的 2'-OMe 改性与 3' 适配器 5' 极端的甲基磷酸盐修饰相结合，有效抑制适配器二聚子。在本文描述的协议中测试此类修改的适配器会很有趣。
协议TS5中的凝胶纯化步骤相对劳动密集型。如果使用经过修改的适配器，可有效减少适配器调暗器的形成，则最终库的凝胶纯化可能不再需要。此外，作为分离小RNA的凝胶纯化步骤的替代方法（步骤1），存在使用磁珠来丰富小RNA的策略（https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf）。我们自身没有使用此方法，但值得测试，如果它工作良好，它可以显著简化协议。
总之，虽然TS5协议可以进一步改进，但它的性能比市售的试剂盒更好，至少在我们之前的比较分析中测试过的试剂盒，用于检测2'OMe sRNA）。可采用自制材料进行跟踪，从而显著降低成本。为了方便，也许更稳定的性能，可以使用TS和Nf试剂盒中的试剂。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家科学研究中心（CNRS）、法国替代能源和原子能委员会（CEA）和巴黎-苏德大学的支持。本研究的所有库制备、光照线测序和生物信息学分析均在I2BC下一代测序（NGS）设施进行。I2BC NGS 设施的成员因对手稿的批判性阅读和有用的建议而得到认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes | |||
References
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