Transplantation de cellules épithéliales mammaires de rat dans le tampon blanc interscapulaire de graisse
Summary
Cet article décrit une méthode de transplantation pour greffer les cellules épithéliales mammaires de rat de distributeur dans le tampon blanc interscapular de graisse des animaux destinataires. Cette méthode peut être utilisée pour examiner les effets de l’hôte et/ou du donneur sur le développement de l’épithélium mammaire et élimine le besoin de pré-compensation, étendant ainsi l’utilité de cette technique.
Abstract
Dès les années 1970, les chercheurs ont réussi à transplanter des cellules épithéliales mammaires dans la coussinet de graisse blanche interscapulaire des rats. La greffe de l’épithélium mammaire à l’aide de techniques de transplantation tire parti de l’environnement hormonal fourni par l’hôte rongeur adolescent. Ces études sont idéalement adaptées pour explorer l’impact de diverses manipulations biologiques sur le développement des glandes mammaires et disséquer de nombreux aspects de la biologie des glandes mammaires. Une caractéristique commune, mais limitante, est que les cellules épithéliales transplantées sont fortement influencées par le stroma environnant et surpassées en concurrence par l’épithélium endogène ; pour employer le tissu mammaire indigène, le tampon blanc abdominal-inguinal de graisse doit être dégagé pour enlever l’épithélium mammaire d’hôte avant la transplantation. Un obstacle majeur lors de l’utilisation de l’organisme modèle de rat est que le dégagement de l’arbre mammaire en développement chez les rats post-soudés n’est pas efficace. Une fois transplantées dans des garnitures sans glande, les cellules épithéliales de distributeur peuvent repeupler le tampon de graisse d’hôte dégagé et former une glande mammaire fonctionnelle. Le tampon de graisse interscapulaire est un endroit alternatif pour ces greffes. Un avantage majeur est qu’il manque de structures canalaires mais fournit le stroma normal qui est nécessaire pour favoriser la croissance épithéliale et est facilement accessible chez le rat. Un autre avantage majeur de cette technique est qu’elle est peu invasive, car elle élimine la nécessité de cautériser et d’enlever l’arbre mammaire endogène en croissance. En outre, le tampon de graisse interscapulaire contient un vaisseau sanguin médial qui peut être utilisé pour séparer les sites pour la greffe. Puisque les glandes endogènes restent intactes, cette technique peut également être employée pour des études comparant la glande mammaire endogène à la glande transplantée. Cet article décrit la méthode de la transplantation épithéliale de cellules mammaires dans le tampon blanc interscapulaire de graisse des rats.
Introduction
Le développement des glandes mammaires postnatales et la morphogénèse canalaire sont des processus largement influencés par la signalisation hormonale au début de la puberté. Chez les souris et les rats, organismes modèles couramment utilisés de la biologie des glandes mammaires, ce processus commence vers l’âge de 3 semaines, où la prolifération et la différenciation rapides entraînent la formation du parenchyme mature. La glande mammaire mature peut subir de nombreuses séries d’expansion et d’involution, une propriété qui a été à l’étude depuis le début du20e siècle. Dans le contexte de l’hyperprolifération et du développement du cancer, des techniques de transplantation de glandes mammaires ont été développées dans les années 19501, et renforcées par la méthodologie quantitative fournie par Gould et coll. en 19772,3,4. Le raffinement de la technique de transplantation chez les rongeurs a contribué à des progrès majeurs dans la compréhension de la biologie normale des glandes mammaires qui sont encore largement utilisés pour étudier l’effet de divers traitements et la manipulation génétique sur le développement normal des glandes mammaires et les états de la maladie.
De nombreuses hypothèses ont été générées et ensuite testées à l’aide de la transplantation de glandes mammaires, décrites pour la première fois par DeOme et coll. en 19591. Des expériences menées sur plusieurs décennies ont montré la propension du tissu canalaire excisé des glandes mammaires des donneurs pour repeupler l’ensemble du coussinet de graisse5,6,7 et ont indiqué qu’un composant critique du développement des glandes mammaires réside dans ces structures épithéliales. Des études ultérieures chez la souris ont montré qu’une seule cellule souche mammaire peut repeupler un coussinet de graisse défriché et a contribué à la découverte d’un ancêtre unique et commun des cellules épithéliales mammaires basales et lumineuses8,9,10. Conformément à ces conclusions, il a été suggéré que la transplantation augmente le bassin de cellules avec un potentiel multilinéaire-repopulation en raison de la plasticité, permettant aux cellules greffées de se développer une glande mammaire fonctionnelle7,10,11,12,13. Fait important, l’utilisation de techniques de transplantation chez les rongeurs surmonte les limites des anomalies induites par la culture cellulaire14 et fournit souvent des résultats en seulement quelques semaines.
Tandis que la procédure a été décrite à l’origine dans le contexte des lésions prénéoplastiques chez les souris, elle a été bientôt étendue aux rats et employée en conjonction avec le traitement cancérogène pour établir la multiplicité comme mesure de la susceptibilité de cancer15,mais la popularité des techniques de transplantation a suivi le développement des outils génétiques pour chaque espèce. Bien que les études de souris incorporant la transplantation aient contribué à de nombreux résultats translationnels, le parenchyme de la glande mammaire de rat ressemble à l’humain plus étroitement16,17 et offre des avantages distincts pour étudier le cancer du sein récepteur-positif d’oestrogène (ERMD). Les tumeurs mammaires sont inducibles chez les deux espèces, mais elles diffèrent en termes de sensibilité hormonale et de profils d’expression génique. Une différence primaire est que les tumeurs mammaires de rat expriment et dépendent de la fonction des récepteurs ovariens et pituitaires d’hormone, à savoir, l’oestrogène et la progestérone (PR), semblables au sous-type luminal-A du cancer du sein humain. En effet, la transplantation épithéliale mammaire, telle que décrite dans ce protocole, a été utilisée pour étudier les variantes génétiques impliquées dans le cancer du sein et déterminer l’autonomie cellulaire des effets sur les cellules épithéliales mammaires18.
En plus de la biologie tumorale, l’épithélium canalaire de la glande mammaire normale de rat montre un niveau plus élevé de ramification et est flanqué d’une couche plus épaisse de stroma que la souris. L’importance du stroma est bien documentée dans les études de transplantation épithéliale mammaire. L’épithélium mammaire doit interagir avec le stroma gras, et idéalement son propre mésenchyme, pour subir sa morphogénèse caractéristique19,20. La greffe de tissu dans une glande mammaire receveure fournit un environnement optimal; cependant, la présence d’épithélium endogène peut interférer avec les résultats. Le préeffacement de la glande mammaire de l’épithélium endogène est généralement exécuté dans les essais de transplantation de souris et exige l’excision chirurgicale du tissu mammaire endogène et/ou l’enlèvement du mamelon1,21,22. Bien que possible, le pré-effacement de l’épithélium mammaire chez les rats après le serrage n’est pas aussi largement exécuté, principalement en raison de l’inefficacité de la compensation de l’arbre mammaire en croissance chez les rats post-serleurs. Puisqu’il a été démontré que les régions du tissu adipeux ailleurs dans le corps pourraient soutenir la croissance de l’épithélium mammaire transplanté21,23,24, le processus de précompensation peut être facilement évité chez les rats en greffant le tissu dans le tampon de graisse blanche interscapulaire.
La méthode de transplantation décrite dans cet article implique l’injection d’organoïdes de glande mammaire enzymatiquement dissociés (fragments d’épithélium canalaire mammaire et d’autres types de cellules capables de morphogénèse) ou de cellules monodispersées dans le coussinet adipeux interscapulaire dans les souches consanguines, isogéniques ou congéniques des rats de laboratoire2. Puisque le tampon interscapulaire de graisse est normalement dépourvu du tissu mammaire, il fournit un environnement approprié pour les emplacements multiples de transplantation sans avoir besoin de pré-défricher l’épithélium endogène. En conséquence, les glandes mammaires abdominales-inguinales de l’animal hôte ne sont pas soumises à une manipulation chirurgicale, se développent normalement et ne peuvent pas interférer avec l’interprétation des résultats. En outre, les glandes mammaires intactes peuvent être utilisées pour la comparaison pour évaluer les effets de l’hôte par rapport aux donneurs sur le développement de l’épithélium mammaire et la tumorigénèse18,25. Bien que le repeuplement de la glande mammaire à partir d’une seule cellule souche est disponible pour les souris, il n’a pas encore été développé pour les rats, principalement en raison du manque de disponibilité d’anticorps à sélectionner pour les cellules souches mammaires rat25,26,27. Malgré cela, la transplantation de cellules épithéliales mammaires monodispersées pour quantifier le potentiel de repeuplement peut être réalisée avec succès, et ces cellules se développeront normalement lorsqu’elles sont greffées dans le cadre approprié2,3,4. Bien que les organoïdes soient bons à de nombreuses fins, les cellules monodispersées sont nécessaires pour des applications quantitatives, par exemple, pour déterminer le nombre de cellules épithéliales mammaires requises pour l’initiation au cancer après le traitement de rayonnement ionisant28 ou pour comparer les caractéristiques des populations épithéliales mammaires sélectionnées par le flux29.
À ce jour, la procédure décrite ici est la méthode la plus robuste d’effectuer la transplantation de glande mammaire chez le rat avec un objectif global d’étudier le développement de glande mammaire et les mécanismes sous-jacents au développement du cancer du sein. Souvent, le donneur et/ou les animaux receveurs sont exposés à différentes variables avant, pendant ou après la transplantation épithéliale. Les exemples incluent des études de gène unique impliquant la carcinogenèse chimique30, rayonnement28,31,32, manipulation génétique du génome hôte/donateur18, et la manipulation hormonale12. Un avantage majeur de la dissociation enzymatique décrite dans ce protocole est la possibilité d’isoler les organoïdes épithélials ou les cellules monodispersées pour des expériences complémentaires impliquant la cytométrie de flux, la culture 3-D, l’édition de gènes, et plus encore. Les applications futures de cette technique comprendront la manipulation supplémentaire du donneur et/ou du tissu hôte avec le génie génétique. Par exemple, les cellules donneuses peuvent être génétiquement modifiées ex vivo à n’importe quel locus génomique choisi à l’aide du système d’édition de gènes CRISPR-Cas9. De même, les rats receveurs peuvent également être génétiquement modifiés pour étudier l’interaction entre les facteurs génétiques du donneur et du receveur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une technique de transplantation épithéliale mammaire optimisée pour travailler avec des rats. Les organoïdes épithéliales mammaires isolés des rats donneurs (3-5 semaines) sont greffés dans le coussinet de graisse blanc interscapulaire des rats receveurs (également 3-5 semaines d’âge). Les résultats peuvent être interprétés aussi peu que 4-6 semaines plus tard, en utilisant la microscopie légère pour examiner le tissu greffé; cependant, la quantité optimale de temps entre la tran…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le Hollings Cancer Center’s Cancer Center’s Cancer Center Support Grant P30 CA138313 financement de la recherche pilote des National Institutes of Health (https://www.nih.gov/), et des fonds du Département de pathologie et de médecine de laboratoire à l’Université médicale de Caroline du Sud. Nous tenons à remercier Marijne Smiths d’avoir enregistré les déclarations d’entrevue.
Materials
| 0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
| 1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
| 100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
| 100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
| 1000 uL pipette tips + pipette | – | – | transferring cells/mixtures/tissue |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
| 40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
| 50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
| 60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
| Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
| Anesthesia vaporizer for veterinary use | – | – | follow institutional protocol |
| Beta-dine or iodine | – | – | |
| Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
| Cell counting apparatus | – | – | |
| Clean animal cages for recovery | – | – | follow institutional protocol |
| Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
| deionized water | – | – | for chemical solutions |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
| EDTA | – | – | monodispersion mixture |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | – | inactivation solution |
| Gauze | – | – | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
| HBSS | GIBCO | – | monodispersion mixture |
| Heating pads | – | – | follow institutional protocol |
| Ice buckets (x2) | – | – | |
| Incubator with orbital rotation | – | – | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
| Isoflurane anesthesia | – | – | follow institutional protocol |
| Light microscope or digital camera | – | – | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
| Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | – | TissueMiser or alternative models |
| Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
| Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | – | – | follow institutional protocol |
| Paper towels or delicate task wipes | – | – | |
| Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
| Postoperative analgesic | – | – | Institutional protocol |
| Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
| Shaver | – | – | electric clippers, or other |
| Staining jars | – | – | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
| Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
| Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | – | – | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
| Syringes: 5 mL (or greater) | – | – | for sterile filtration of collagenase digestion media |
| Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
| Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | – | – | |
| Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |
Riferimenti
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