Rat mammary Epithelial Cell Transplantation nel Pad Grasso Bianco Interscapular
Summary
Questo articolo descrive un metodo di trapianto per innestare cellule epiteliali mammarie del donatore nel cuscinetto di grasso bianco interscapular degli animali riceventi. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare gli effetti dell’ospite e/o del donatore sullo sviluppo dell’epitelio mammario ed elimina la necessità di pre-clearing, estendendo così l’utilità di questa tecnica.
Abstract
Già negli anni ’70, i ricercatori hanno trapiantato con successo cellule epiteliali mammarie nel cuscinetto di grasso bianco interscapoare dei ratti. L’innesto dell’epitelio mammario con tecniche di trapianto sfrutta l’ambiente ormonale fornito dall’ospite di roditori adolescenti. Questi studi sono ideali per esplorare l’impatto di varie manipolazioni biologiche sullo sviluppo della ghiandola mammaria e sezionare molti aspetti della biologia della ghiandola mammaria. Una caratteristica comune, ma limitante, è che le cellule epiteliali trapiantate sono fortemente influenzate dallo stroma circostante e superate dall’epitelio endogeno; per utilizzare il tessuto mammario nativo, il cuscinetto di grasso bianco addominale-inguinale deve essere eliminato per rimuovere l’epitelio mammario ospite prima del trapianto. Un ostacolo importante quando si utilizza l’organismo modello di ratto è che la cancellazione dell’albero mammario in via di sviluppo nei ratti post-svezzamento non è efficiente. Quando trapiantate in cuscinetti di grasso privi di ghiandola, le cellule epiteliali del donatore possono ripopolare il cuscinetto di grasso ospite eliminato e formare una ghiandola mammaria funzionale. Il cuscinetto di grasso interscapular è una posizione alternativa per questi innesti. Un grande vantaggio è che manca di strutture frandutali ma fornisce il normale stroma che è necessario per promuovere la crescita epiteliale ed è facilmente accessibile nel ratto. Un altro grande vantaggio di questa tecnica è che è minimamente invasiva, perché elimina la necessità di cauterizzare e rimuovere l’albero di mammifero endogeno in crescita. Inoltre, il cuscinetto di grasso interscapular contiene un vaso sanguigno mediale che può essere utilizzato per separare i siti per l’innesto. Poiché le ghiandole endogene rimangono intatte, questa tecnica può essere utilizzata anche per studi che confrontano la ghiandola mammaria endogena con la ghiandola trapiantata. Questo documento descrive il metodo di trapianto di cellule epiteliali mammarie nel cuscinetto di grasso bianco interscapular di ratti.
Introduction
Lo sviluppo della ghiandola mammaria postnatale e la morfogenesi duttale sono processi in gran parte influenzati dalla segnalazione ormonale all’inizio della pubertà. Nei topi e nei ratti, organismi modello comunemente usati della biologia della ghiandola mammaria, questo processo inizia intorno a 3 settimane di età, dove la rapida proliferazione e differenziazione provocano la formazione del parenchyma maturo. La ghiandola mammaria matura può subire numerosi cicli di espansione e involuzione, una proprietà che è stata in fase di studio fin dall’inizio del XXsecolo. Nel contesto dell’iperproliferazione e dello sviluppo del cancro, le tecniche di trapianto di ghiandola mammaria sono state sviluppate negli anni ’501e potenziate dalla metodologia quantitativa richiesta da Gould et al. nel 19772,3,4. Il perfezionamento della tecnica di trapianto nei roditori ha contribuito a importanti progressi nella comprensione della normale biologia della ghiandola mammaria che sono ancora ampiamente utilizzati per studiare l’effetto di vari trattamenti e la manipolazione genetica sullo sviluppo normale della ghiandola mammaria e sugli stati della malattia.
Molte ipotesi sono state generate e successivamente testate utilizzando il trapianto di ghiandola mammaria, descritto per la prima volta da DeOme et al. Gli esperimenti di diversi decenni hanno mostrato la propensione del tessuto duttale ascisa dalle ghiandole mammarie del donatore per ripopolare l’intero cuscinetto a grasso5,6,7 e ha indicato che una componente critica dello sviluppo della ghiandola mammaria risiede in queste strutture epiteliali. Studi successivi sui topi hanno mostrato che una singola cellula staminale mammaria può ripopolare un cuscinetto di grasso eliminato e ha contribuito alla scoperta di un singolo progenitore comune di cellule epiteliali mammarie basali e luminali8,9,10. In linea con queste conclusioni, è stato suggerito che il trapianto aumenti il pool di cellule con potenziale di ripopolamento multilineato a causa della plasticità, permettendo alle cellule innestate di coltivare una ghiandola mammaria funzionale7,10,11,12,13. È importante sottolineare che l’uso di tecniche di trapianto nei roditori supera i limiti delle anomalie indotte dalla coltura cellulare14 e spesso fornisce risultati in poche settimane.
Mentre la procedura è stata originariamente descritta nel contesto delle lesioni preneoplastiche nei topi, è stata presto ampliata ai ratti e utilizzata in combinazione con il trattamento cancerogeno per stabilire la molteplicità come misura della suscettibilità al cancro15, ma la popolarità delle tecniche di trapianto ha seguito lo sviluppo di strumenti genetici per ogni specie. Anche se gli studi sui topi che incorporano il trapianto hanno contribuito a molti risultati traslazionali, il parenchyma della ghiandola mammaria del ratto assomiglia più da vicinoall’uomo 16,17 e offre vantaggi distinti per lo studio del cancro al seno del recettore estrogeno-positivo (ER). I tumori mammari sono inducibili in entrambe le specie, ma differiscono in termini di sensibilità ormonale e profili di espressione genica. Una differenza primaria è che i tumori mammari del ratto esprimono e dipendono dalla funzione dei recettori dell’ormone ovarico e ipofisario, vale a dire, estrogeni e progesterone (PR), simile al sottotipo luminale-A del cancro al seno umano. Infatti, il trapianto di cellule epiteliali mammarie, come descritto in questo protocollo, è stato utilizzato per studiare le varianti genetiche coinvolte nel cancro al seno e determinare l’autonomia cellulare degli effetti sulle cellule epiteliali mammarie18.
Oltre alla biologia tumorale, l’epitelio duttale della normale ghiandola mammaria del ratto presenta un livello più elevato di ramificazione ed è affiancato da uno strato più spesso di stroma rispetto al topo. L’importanza dello stroma è ben documentata negli studi sui trapianti epiteliali mammari. L’epitelio mammario deve interagire con stroma grasso, e idealmente il proprio mesenchyme, per sottoporsi alla sua caratteristica morfogenesi19,20. L’innesto del tessuto in una ghiandola mammaria ricevente fornisce un ambiente ottimale; tuttavia, la presenza di epitelio endogeno può interferire con i risultati. Il preclearing della ghiandola mammaria dell’epitelio endogeno è comunemente eseguito nei saggi di trapianto di topi e richiede l’escissione chirurgica del tessuto mammario endogeno e/o la rimozione del capezzolo1,21,22. Anche se possibile, il preclearing dell’epitelio mammario nei ratti post-svezzamento non è così ampiamente eseguito, principalmente a causa dell’inefficacia di cancellare l’albero mammario in crescita nei ratti post-svezzamento. Dal momento che è stato dimostrato che le regioni del tessuto adiposo altrove nel corpo potrebbero sostenere la crescita dell’epitelio mammario trapiantato21,23,24, il processo di preclearing può essere facilmente evitato nei ratti innestando tessuto nella pastiglia bianca interscapoare.
Il metodo di trapianto descritto in questo documento prevede l’iniezione di organoidi della ghiandola mammaria enzimaticamente dissociata (frammenti di epitelio duttile mammario e altri tipi di cellule in grado di morfogenesi) o cellule monodisperse nel lassogio di grasso interscapoare in ceppi inbred, isogenici o congenici di ratti di laboratorio2 . Poiché la macchia di grasso interscalpulare è normalmente priva di tessuto mammario, fornisce un ambiente adatto per più siti di trapianto senza la necessità di epitelio endogeno pre-chiaro. Di conseguenza, le ghiandole mammarie endogene dell’animale ospite non sono soggette a manipolazione chirurgica, si sviluppano normalmente e non possono interferire con l’interpretazione dei risultati. Inoltre, le ghiandole mammarie intatte possono essere utilizzate per il confronto per valutare gli effetti dell’ospite rispetto al donatore sullo sviluppo dell’epitelio mammario e sulla tumorigenesi18,25. Anche se il ripopolamento della ghiandola mammaria da una singola cellula staminale è disponibile per i topi, non è ancora stato sviluppato per il ratto, principalmente a causa della mancanza di disponibilità di anticorpi da selezionare per le cellule staminali mammarie diratto 25,26,27. Nonostante questo, il trapianto di cellule epiteliali mammarie monodisperse per quantificare il potenziale di ripopolamento può essere eseguito con successo, e quelle cellule si svilupperanno normalmente quando innestate nel quadro appropriato2,3,4. Mentre gli organoidi sono buoni per molti scopi, le cellule monodisperse sono necessarie per applicazioni quantitative, ad esempio, per determinare il numero di cellule epiteliali mammarie necessarie per l’avvio del cancro in seguito al trattamento con radiazioni ionizzanti28 o per confrontare le caratteristiche del flusso citometricamente selezionato popolazione di cellule epiteliali29.
Ad oggi, la procedura qui descritta è il metodo più robusto per eseguire il trapianto di ghiandola mammaria nel ratto con l’obiettivo generale di studiare lo sviluppo della ghiandola mammaria e i meccanismi alla base dello sviluppo del cancro al seno. Spesso, il donatore e/o gli animali ricittori sono esposti a variabili diverse prima, durante o dopo il trapianto epiteliale. Gli esempi includono studi genetici singoli che coinvolgono la carcinogenesi chimica30, radiazioni28,31,32, manipolazione genetica del genoma ospite/donatore18e manipolazione ormonale12. Uno dei principali vantaggi della dissociazione enzimatica descritta in questo protocollo è l’opportunità di isolare organoidi epiteliali o cellule monodisperse per esperimenti complementari che coinvolgono citometria di flusso, coltura 3D, modifica genica e altro ancora. Le future applicazioni di questa tecnica includeranno un’ulteriore manipolazione del donatore e/o del tessuto ospite con l’ingegneria genetica. Ad esempio, le cellule donatrici possono essere geneticamente modificate ex vivo in qualsiasi locus genomico scelto utilizzando il sistema di editing genico CRISPR-Cas9. Allo stesso modo, i ratti riceventi possono anche essere geneticamente modificati per studiare l’interazione tra fattori genetici ingegnerizzati del donatore e del ricevente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive una tecnica di trapianto di cellule epiteliali mammarie ottimizzata per lavorare con i ratti. Gli organoidi epiteliali mammari isolati dai ratti donatori (3-5 settimane di età) vengono innestati nel cuscinetto di grasso bianco interscapular dei ratti ricitti (anche 3-5 settimane di età). I risultati possono essere interpretati appena 4-6 settimane dopo, utilizzando la microscopia leggera per esaminare il tessuto innestato; tuttavia, la quantità ottimale di tempo tra il trapianto e il sacrifi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal Cancer Center Di Hollings Cancer Center Support Grant P30 CA138313 finanziamenti pilota di ricerca dal National Institutes of Health(https://www.nih.gov/)e fondi dal Dipartimento di Patologia & Medicina di laboratorio presso la Medical University of South Carolina. Ringraziamo Marijne Smiths per aver registrato le dichiarazioni dell’intervista.
Materials
| 0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
| 1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
| 100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
| 100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
| 1000 uL pipette tips + pipette | – | – | transferring cells/mixtures/tissue |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
| 40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
| 50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
| 60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
| Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
| Anesthesia vaporizer for veterinary use | – | – | follow institutional protocol |
| Beta-dine or iodine | – | – | |
| Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
| Cell counting apparatus | – | – | |
| Clean animal cages for recovery | – | – | follow institutional protocol |
| Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
| deionized water | – | – | for chemical solutions |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
| EDTA | – | – | monodispersion mixture |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | – | inactivation solution |
| Gauze | – | – | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
| HBSS | GIBCO | – | monodispersion mixture |
| Heating pads | – | – | follow institutional protocol |
| Ice buckets (x2) | – | – | |
| Incubator with orbital rotation | – | – | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
| Isoflurane anesthesia | – | – | follow institutional protocol |
| Light microscope or digital camera | – | – | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
| Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | – | TissueMiser or alternative models |
| Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
| Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | – | – | follow institutional protocol |
| Paper towels or delicate task wipes | – | – | |
| Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
| Postoperative analgesic | – | – | Institutional protocol |
| Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
| Shaver | – | – | electric clippers, or other |
| Staining jars | – | – | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
| Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
| Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | – | – | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
| Syringes: 5 mL (or greater) | – | – | for sterile filtration of collagenase digestion media |
| Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
| Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | – | – | |
| Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |
Riferimenti
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Ricerca sul cancro. 19 (5), 515-520 (1959).
- Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
- Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343 (1977).
- Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
- Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
- Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
- Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173 (1988).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
- Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
- Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
- Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634 (1965).
- Beuving, L. J., Faulkin, L. J., DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
- Russo, J., Rubin, E., Damjanov, I., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. , 217-251 (1990).
- Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
- Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002 (2019).
- Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
- Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Biologia dello sviluppo. 91 (1), 202-207 (1982).
- Faulkin, L. J., Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
- Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
- Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
- Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
- Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).
- Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
- Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
- Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Ricerca sul cancro. 46 (5), 2390-2395 (1986).
- Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
- Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
- Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
- Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
- Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
- Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
- Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
- Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
- Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology – Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
- Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
- Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
- Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
- Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Biologia dello sviluppo. 72 (2), 201-210 (1979).
- Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
- Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
- Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).
