Transplante de células epiteliais mamárias no Bloco de Gordura Branca Interscapular
Summary
Este artigo descreve um método de transplante para enxertar células epiteliais mamárias doadoras na almofada de gordura branca interscapular de animais receptores. Este método pode ser usado para examinar os efeitos do hospedeiro e/ou doador no desenvolvimento do epitélio mamário e elimina a necessidade de pré-compensação, estendendo assim a utilidade desta técnica.
Abstract
Já na década de 1970, pesquisadores transplantaram com sucesso células epiteliais mamárias na almofada de gordura branca interscapular de ratos. Enxerto de epitélio mamário usando técnicas de transplante aproveita o ambiente hormonal fornecido pelo hospedeiro adolescente roedor. Esses estudos são idealmente adequados para explorar o impacto de várias manipulações biológicas no desenvolvimento da glândula mamária e dissecam muitos aspectos da biologia da glândula mamária. Uma característica comum, mas limitante, é que as células epiteliais transplantadas são fortemente influenciadas pelo estroma circundante e superadas pelo epitélio endógeno; para utilizar tecido mamário nativo, a almofada de gordura branca abdominais deve ser liberada para remover o epitélio mamário hospedeiro antes do transplante. Um grande obstáculo ao usar o organismo modelo de rato é que limpar a árvore mamária em desenvolvimento em ratos pós-desacidos não é eficiente. Quando transplantadas em almofadas de gordura sem glândulas, as células epiteliais doadora podem repovoar o bloco de gordura de hospedeiro limpo e formar uma glândula mamária funcional. O bloco de gordura interscapular é um local alternativo para esses enxertos. Uma grande vantagem é que ele carece de estruturas ductais, mas fornece o estroma normal necessário para promover o crescimento epitelial e é facilmente acessível no rato. Outra grande vantagem dessa técnica é que ela é minimamente invasiva, pois elimina a necessidade de cauterizar e remover a crescente árvore mamária endógena. Além disso, a almofada de gordura interscapular contém um vaso sanguíneo medial que pode ser usado para separar locais para enxerto. Como as glândulas endógenas permanecem intactas, essa técnica também pode ser usada para estudos comparando a glândula mamária endógena à glândula transplantada. Este artigo descreve o método de transplante de células epiteliais mamárias na almofada de gordura branca interscapular de ratos.
Introduction
O desenvolvimento da glândula mamária pós-natal e a morfogênese ductal são processos em grande parte influenciados pela sinalização hormonal no início da puberdade. Em camundongos e ratos, comumente utilizados organismos modelo saem da biologia da glândula mamária, esse processo começa por volta de 3 semanas de idade, onde a rápida proliferação e diferenciação resultam na formação do parenchyma maduro. A glândula mamária madura pode passar por inúmeras rodadas de expansão e involução, uma propriedade que está investigação desde o início do séculoXX. No contexto de hiperproliferação e desenvolvimento do câncer, foramdesenvolvidastécnicas de transplante de glândulas mamárias na década de 1950 , e reforçadas pela metodologia quantitativa contribuída por Gould et al. em 19772,3,4. O refinamento da técnica de transplante em roedores tem contribuído para grandes avanços na compreensão da biologia da glândula mamária normal que ainda são amplamente utilizados para estudar o efeito de vários tratamentos e manipulação genética em estados normais de desenvolvimento de glândulas mamárias e doenças.
Muitas hipóteses foram geradas e posteriormente testadas usando transplante de glândula mamária, descrita pela primeira vez por DeOme et al. em 19591. Experimentos ao longo de várias décadas mostraram a propensão do tecido ductal excida das glândulas mamárias doadoras para repovoar todo o bloco de gordura5,6,7 e indicou que um componente crítico do desenvolvimento da glândula mamária reside nessas estruturas epiteliais. Estudos posteriores em camundongos mostraram que uma única célula-tronco mamária pode repovoar um bloco de gordura limpo e contribuiu para a descoberta de um único progenitor comum de células epiteliais mamárias basais e luminal8,9,10. De acordo com essas conclusões, foi sugerido que o transplante aumenta o pool de células com potencial multilineage-repopulando como resultado da plasticidade, permitindo que as células enxertadas cresçam uma glândula mamária funcional7,10,11,12,13. É importante ressaltar que o uso de técnicas de transplante em roedores supera as limitações das anormalidades induzidas pela cultura celular14 e muitas vezes fornece resultados em apenas uma questão de semanas.
Embora o procedimento tenha sido originalmente descrito no contexto de lesões pré-neoplásticas em camundongos, logo foi expandido para ratos e utilizado em conjunto com o tratamento cancerígeno para estabelecer a multiplicidade como medida de suscetibilidade do câncer15,mas a popularidade das técnicas de transplante tem acompanhado o desenvolvimento de ferramentas genéticas para cada espécie. Embora estudos de camundongos que incorporem o transplante tenham contribuído com muitos achados translacionais, o parenchyma da glândula mamária ratana se assemelha ao humano mais de perto16,17 e oferece vantagens distintas para estudar o câncer de mama receptor-positivo (ER+) de estrogênio. Os tumores mamários são indutíveis em ambas as espécies, mas diferem em termos de sensibilidade hormonal e perfis de expressão genética. A principal diferença é que os tumores mamários de ratos expressam e dependem da função dos receptores hormonais ovarianos e pituitários, ou seja, estrogênio e progesterona (PR), semelhante ao subtipo luminal-A do câncer de mama humano. De fato, o transplante de células epiteliais mamárias, como descrito neste protocolo, tem sido usado para estudar variantes genéticas envolvidas no câncer de mama e determinar a autonomia celular dos efeitos sobre as células epiteliais mamárias18.
Além da biologia tumoral, o epitélio ductal da glândula mamária normal exibe um nível mais alto de ramificação e é ladeado por uma camada mais grossa de estromatário do que o rato. A importância do estroma está bem documentada nos estudos de transplante epitelial mamária. O epitélio mamário deve interagir com estroma gorduroso, e idealmente seu próprio mesenchyme, para se submeter à sua morfogênese característica19,20. O tecido de enxerto em uma glândula mamária receptora fornece um ambiente ideal; no entanto, a presença de epitélio endógeno pode interferir nos resultados. A pré-limpeza da glândula mamária do epitélio endógeno é comumente realizada em ensaios de transplante de camundongos e requer excisão cirúrgica de tecido mamário endógeno e/ou remoção do mamilo1,21,22. Embora possível, a pré-compensação do epitélio mamário em ratos pós-desagrecidos não é tão amplamente realizada, principalmente devido à ineficácia de limpar a crescente árvore mamária em ratos pós-desagrecidos. Uma vez demonstrado que regiões de tecido adiposo em outros lugares do corpo poderiam apoiar o crescimento do epitélio mamário transplantado21,23,24, o processo de pré-limpeza pode ser facilmente evitado em ratos enxertando tecido no bloco de gordura branca interscapular.
O método de transplante descrito neste artigo envolve a injeção de organoides de glândula mamária enzimática (fragmentos de epitélio ductal mamário e outros tipos de células capazes de morfogênese) ou células monodispersas na almofada de gordura interscapular em cepas de ratos de laboratório, isogênicos ou congênicos de ratos de laboratório2. Como a almofada de gordura interscapular é normalmente desprovida de tecido mamário, fornece um ambiente adequado para múltiplos locais de transplante sem a necessidade de pré-limpar o epitélio endógeno. Como resultado, as glândulas mamárias endógenas e abdominais do animal hospedeiro não estão sujeitas à manipulação cirúrgica, desenvolver-se normalmente e não podem interferir na interpretação dos resultados. Além disso, as glândulas mamárias intactas podem ser usadas para comparação para avaliar os efeitos do hospedeiro versus doador no desenvolvimento de epitélio mamário e tumorigênese18,25. Embora a repopulação da glândula mamária de uma única célula-tronco esteja disponível para ratos, ela ainda não foi desenvolvida para ratos, principalmente devido à falta de disponibilidade de anticorpos para selecionar para células-tronco mamárias de ratos25,26,27. Apesar disso, o transplante de células epiteliais mamárias monodispersas para quantificar o potencial de repopulação pode ser realizado com sucesso, e essas células se desenvolverão normalmente quando enxertadas na estrutura apropriada2,3,4. Embora os organoides sejam bons para muitos propósitos, as células monodispersas são necessárias para aplicações quantitativas, por exemplo, para determinar o número de células epiteliais mamárias necessárias para a iniciação do câncer após o tratamento ionizante de radiação28 ou para comparar características do fluxo citometricamente selecionados populações epiteliais epiteliais29.
Até o momento, o procedimento descrito aqui é o método mais robusto de realização do transplante de glândula mamária no rato com o objetivo geral de estudar o desenvolvimento da glândula mamária e os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do câncer de mama. Muitas vezes, os animais doadores e/ou receptores são expostos a diferentes variáveis antes, durante ou após o transplante epitelial. Exemplos incluem estudos genéticos únicos envolvendo carcinogênese química30, radiação28,31,32, manipulação genética do genoma hospedeiro/doador18, e manipulação hormonal12. Uma grande vantagem da dissociação enzimática descrita neste protocolo é a oportunidade de isolar organoides epiteliais ou células monodispersas para experimentos complementares envolvendo citometria de fluxo, cultura 3D, edição de genes e muito mais. Aplicações futuras desta técnica incluirão manipulação adicional de tecido doador e/ou hospedeiro com engenharia genética. Por exemplo, as células doadoras podem ser geneticamente alteradas ex vivo em qualquer lócus genômico escolhido usando o sistema de edição de genes CRISPR-Cas9. Da mesma forma, os ratos receptores também podem ser geneticamente alterados para estudar a interação entre doadores e fatores genéticos projetados por doadores e receptores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve uma técnica de transplante de células epiteliais mamáriaotimizada para trabalhar com ratos. Organoides epiteliais mamários isolados de ratos doadores (3-5 semanas de idade) são enxertados na almofada de gordura branca interscapular de ratos receptores (também de 3 a 5 semanas de idade). Os resultados podem ser interpretados apenas 4-6 semanas depois, usando microscopia leve para examinar o tecido enxertado; no entanto, a quantidade ideal de tempo entre transplante e sacrifício deve ser dete…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Apoio ao Câncer do Hollings Cancer Center Grant P30 CA138313 financiamento de pesquisa piloto dos Institutos Nacionais de Saúde (https://www.nih.gov/),e recursos do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade Médica da Carolina do Sul. Gostaríamos de agradecer marijne Smiths por gravar as declarações da entrevista.
Materials
| 0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
| 1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
| 100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
| 100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
| 1000 uL pipette tips + pipette | – | – | transferring cells/mixtures/tissue |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
| 40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
| 50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
| 60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
| Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
| Anesthesia vaporizer for veterinary use | – | – | follow institutional protocol |
| Beta-dine or iodine | – | – | |
| Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
| Cell counting apparatus | – | – | |
| Clean animal cages for recovery | – | – | follow institutional protocol |
| Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
| deionized water | – | – | for chemical solutions |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
| EDTA | – | – | monodispersion mixture |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | – | inactivation solution |
| Gauze | – | – | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
| HBSS | GIBCO | – | monodispersion mixture |
| Heating pads | – | – | follow institutional protocol |
| Ice buckets (x2) | – | – | |
| Incubator with orbital rotation | – | – | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
| Isoflurane anesthesia | – | – | follow institutional protocol |
| Light microscope or digital camera | – | – | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
| Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | – | TissueMiser or alternative models |
| Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
| Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | – | – | follow institutional protocol |
| Paper towels or delicate task wipes | – | – | |
| Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
| Postoperative analgesic | – | – | Institutional protocol |
| Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
| Shaver | – | – | electric clippers, or other |
| Staining jars | – | – | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
| Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
| Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | – | – | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
| Syringes: 5 mL (or greater) | – | – | for sterile filtration of collagenase digestion media |
| Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
| Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | – | – | |
| Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |
Riferimenti
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