쥐 유방 상피 세포 이식에 갑피 흰 지방 패드
Summary
본 문서는 수용자 동물의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 기증자 쥐 유방 상피 세포를 이식하는 이식 방법을 설명합니다. 이 방법은 유방 상피 발달에 호스트 및/또는 기증자 효력을 검토하기 위하여 이용될 수 있고 사전 정리를 위한 필요를 제거하여, 이 기술의 유용성을 확장합니다.
Abstract
1970년대 초, 연구자들은 유방 상피 세포를 쥐의 중간 절단 된 흰색 지방 패드로 성공적으로 이식했습니다. 이식 기술을 사용하여 유방 상피를 이식하는 것은 사춘기 설치류 호스트가 제공하는 호르몬 환경을 이용합니다. 이 연구 결과는 이상적으로 유선 발달에 각종 생물학 조작의 충격을 탐구하고 유선 생물학의 많은 양상을 해부하기 위하여 적당합니다. 일반적인, 그러나 제한, 특징은 이식된 상피 세포가 강하게 주변 기질에 의해 영향을 받고 내인성 상피에 의해 경쟁된다는 것입니다; 네이티브 유방 조직을 이용하기 위하여는, 복부 inguinal 백색 지방 패드는 이식의 앞에 호스트 유방 상피를 제거하기 위하여 삭제되어야 합니다. 쥐 모형 유기체를 사용할 때 중요한 장애물은 포스트 위들링 한 쥐에서 개발 유방 나무를 지우는 것이 효율적이지 않다는 것입니다. 선 없는 지방 패드로 이식 하는 경우, 기증자 상피 세포 는 삭제 된 호스트 지방 패드를 다시 채우고 기능성 유선을 형성 할 수 있습니다. 중간 지방 패드는 이러한 접목에 대 한 대체 위치. 주요 장점은 그것은 덕트 구조부족 아직 상피 성장을 촉진하는 데 필요한 정상 기질을 제공하고 쥐에서 쉽게 접근 할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 또 다른 주요 장점은 최소 침습적이라는 것입니다. 추가적으로, 중간 지방 패드는 접목을 위한 사이트를 분리하기 위하여 이용될 수 있는 내측 혈관을 포함합니다. 내 인 성 동맥 그대로 남아 있기 때문에, 이 기술은 또한 이식 된 동맥에 내 인 성 유선 비교 연구에 사용할 수 있습니다. 이 논문은 쥐의 간경엽 백색 지방 패드로 유방 상피 세포 이식의 방법을 설명합니다.
Introduction
출생 후 유방 선 발달 및 덕트 형태 형성은 사춘기의 개시에 호르몬 신호에 의해 크게 영향을 받은 프로세스입니다. 쥐와 쥐에서, 유선 생물학의 일반적으로 사용되는 모형 유기체에서는, 이 프로세스는 성숙한 자렌치종의 대형귀착되는 급속한 증식 및 분화 귀착되는 나이의 약 3 주에서 시작됩니다. 성숙한 유방 동맥은 확장과 불굴의 수많은 라운드를 겪을 수 있습니다, 초기 20세기 부터 조사를받고있다 속성. 과확산과 암 발달의 맥락에서, 유선 이식 기술은 1950년대1에개발되었고, 1977년2,3,4. 설치류에서 이식 기술의 정제는 여전히 널리 정상적인 유선 개발 및 질병 상태에 대한 다양한 치료 및 유전 조작의 효과를 연구하는 데 사용되는 정상적인 유선 생물학을 이해하는 주요 발전에 기여하고있다.
많은 가설이 생성되고 이후에 유선 이식을 사용하여 시험되었습니다, DeOme 외에 의해 처음 기술된 19591. 수십 년에 걸친 실험은 전체 지방 패드5,6,7을 다시 채우기 위해 기증자 유방 땀샘에서 절제된 덕트 조직의 성향을 보여주었고, 유선 발달의 중요한 성분이 이러한 상피 구조에 존재한다는 것을 나타냈다. 나중에 마우스에서 연구한 결과, 단일 유방 줄기 세포가 지운 지방 패드를 다시 채울 수 있고 기저 및 발광 유방 상피 세포의 단일, 일반적인 전구의 발견에 기여할 수 있음을 보여주었다8,9,10. 이러한 결론에 따라, 이식은 가소성의 결과로 다선 재채기 잠재력을 가진 세포의 풀을 증가시켜 접목 된 세포가 기능성 유선7,10,11,12,13을성장시킬 수 있도록 하는 것이 제안되었다. 중요한 것은, 설치류에서 이식 기술의 사용은 세포 배양 유발이상(14)의 한계를 극복하고 종종 단지 몇 주 만에 결과를 제공한다.
절차는 원래 마우스에 있는 preneoplastic 병변의 맥락에서 기술된 동안, 그것은 곧 쥐로 확장하고 암 감수성의 측정으로 다형성을 확립하기 위하여 발암물질 처리와 함께 이용되었습니다15,그러나 이식 기술의 대중성은 각 종에 대한 유전 공구의 발달을 따랐습니다. 이식을 통합하는 마우스 연구 결과는 많은 번역 사실 인정을 기여했더라도, 쥐 유방 선의 garenchyma는 인간을 더 밀접하게 닮은16,17 및 에스트로겐 수용체 양성 (ER+) 유방암을 공부를 위한 명백한 이점을 제안합니다. 유방 종양은 두 종에서 유도할 수 있습니다, 그러나 호르몬 감도 및 유전자 발현 단면도식으로 다릅니다. 1 차적인 다름은 쥐 유방 종양이 표현하고 난소와 뇌하수체 호르몬 수용체, 즉, 에스트로겐과 황체 호르몬 (PR)의 기능에 달려 있다는 것입니다, 인간 유방암의 발광A 특수형과 유사. 실제로, 유방 상피 세포 이식은, 본 프로토콜에 기재된 바와 같이, 유방암에 관여하는 유전적 변이체를 연구하고 유방 상피 세포에 대한 영향의 세포 자율성을 결정하는 데 사용되어 왔다18.
종양 생물학 이외에, 일반적인 래트 유방 선의 덕트 상피는 분지의 더 높은 수준을 전시하고 마우스 보다는 기의 두꺼운 층에 의해 측면됩니다. 기질의 중요성은 유방 상피 이식 연구 결과에서 잘 문서화됩니다. 유방 상피는 지방 기질과 상호 작용해야하며, 이상적으로는 그 자체의 중간엽으로 특징적인 형태 형성19,20을겪어야합니다. 수용자 유선으로 조직을 이식하는 것은 최적의 환경을 제공합니다. 그러나, 내인성 상피의 존재는 결과를 방해할 수 있습니다. 내인성 상피의 유방 선사전 클리어링은 일반적으로 마우스 이식 검사에서 수행되며 내인성 유방 조직의 외과 적 절제 및 / 또는 젖꼭지 의제거가필요합니다1,21,22. 가능하지만, 유동 후 쥐에서 유방 상피를 미리 지우는 것은 널리 수행되지 않습니다, 주로 때문에 후 weanling 쥐에서 성장하는 유방 나무를 지우기의 무효. 체내 의 지방 조직의 영역이 이식 된 유방 상피21,23,24의성장을 지원할 수 있음을 보여주었기 때문에, 조직을 중간 흰색 지방 패드로 이식하여 쥐에서 사전 지우기 과정을 쉽게 피할 수 있습니다.
이 논문에 기술된 이식 방법은 효소 해리 유방 선 오르가노이드 (유방 덕트 상피 및 형태 형성이 가능한 다른 세포 유형의 단편) 또는 실험실 쥐의 인간, 등소 성 또는 인원성 균주에서 간경질 지방 패드에 단산분리 된 세포를 주입하는 것을 포함합니다2. 간경막 지방 패드는 일반적으로 유방 조직이 없기 때문에, 내인성 상피를 미리 지울 필요없이 여러 이식 부위에 적합한 환경을 제공합니다. 그 결과, 숙주 동물의 내인성, 복부 인과 유방 땀샘은 외과 조작의 대상이 되지 않으며 정상적으로 발달하며 결과 해석을 방해할 수 없습니다. 부가적으로, 온전한 유방 땀샘은 유방 상피 발달 및 종양발생에 대한 호스트 대 공여자 효과를 평가하기 위해 비교를 위해 사용될 수있다 18,25. 단일 줄기 세포로부터 유방선의 재모집단은 마우스에 사용할 수 있지만, 쥐를 위해 아직 개발되지 않았으며, 주로 쥐 유방 줄기 세포25,26,27을선택할 항체의 가용성부족으로 인해 개발되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 재채백 전위를 정량화하기 위해 단산이 분산된 유방 상피 세포의 이식은 성공적으로 수행될 수 있고, 이들 세포는 적절한 프레임워크2,3,4로이식될 때 정상적으로 발전할 것이다. 오르가노이드는 여러 가지 용도로 양호하지만, 단산성 세포는 양적 적용을 위해 요구되며, 예를 들어, 이온화 방사선치료(28)에 이어 암 개시에 필요한 유방 상피 세포의 수를 결정하거나 세포학적으로 선택된 유방 상피 세포 집단의 특성을 비교하기 위해29.
현재까지, 여기에 설명 된 절차는 유방 선 개발 및 유방암 발달의 기본 메커니즘을 연구하는 전반적인 목표를 가진 쥐에서 유선 이식을 수행하는 가장 강력한 방법입니다. 종종, 기증자 및/또는 수용자 동물은 상피 이식 전, 도중 또는 후에 다른 변수에 드러릅니다. 예로는 화학발암 발생30,방사선28,31,32,호스트/공여자 게놈18의유전자 조작 및 호르몬 조작12를포함하는 단일 유전자 연구가 있다. 이 프로토콜에 기술된 효소 해리의 주요 장점은 유세포 분석, 3-D 배양, 유전자 편집 등을 포함하는 상피 오르가노이드 또는 단산성 세포를 분리할 수 있는 기회입니다. 이 기술의 미래 응용 프로그램은 유전 공학기증자 및 / 또는 호스트 조직의 추가 조작을 포함 할 것이다. 예를 들어, 공여자 세포는 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템을 사용하여 임의의 선택된 게놈 궤적에서 생체 외 를 유전적으로 변경할 수 있다. 유사하게, 수신자 쥐는 또한 기증자와 수령인 공학한 유전 요인 사이 상호 작용을 공부하기 위하여 유전으로 변경될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 쥐와 함께 작동하기 위해 최적화 된 유방 상피 세포 이식 기술을 설명합니다. 기증자 쥐에서 격리 된 유방 상피 오르가노이드 (나이의 3-5 주)는 수용자 쥐의 중간 흰색 지방 패드로 접목됩니다 (또한 3-5 주). 결과는 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 이식된 조직을 검사하기 위하여 4-6 주 후에 조금으로 해석될 수 있습니다; 그러나, 이식과 희생 사이의 최적의 시간은 전체 실험을 구?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 홀링스 암 센터의 암 센터 지원 교부금 P30 CA138313 국립 보건원(https://www.nih.gov/)의파일럿 연구 자금과 사우스 캐롤라이나 의과 대학의 병리학 및 실험실 의학부의 기금에 의해 지원되었습니다. 인터뷰 진술서를 녹음해 주신 마리진 스미스에게 감사드립니다.
Materials
| 0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
| 1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
| 100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
| 100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
| 1000 uL pipette tips + pipette | – | – | transferring cells/mixtures/tissue |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
| 40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
| 50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
| 60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
| Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
| Anesthesia vaporizer for veterinary use | – | – | follow institutional protocol |
| Beta-dine or iodine | – | – | |
| Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
| Cell counting apparatus | – | – | |
| Clean animal cages for recovery | – | – | follow institutional protocol |
| Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
| deionized water | – | – | for chemical solutions |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
| EDTA | – | – | monodispersion mixture |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | – | inactivation solution |
| Gauze | – | – | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
| HBSS | GIBCO | – | monodispersion mixture |
| Heating pads | – | – | follow institutional protocol |
| Ice buckets (x2) | – | – | |
| Incubator with orbital rotation | – | – | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
| Isoflurane anesthesia | – | – | follow institutional protocol |
| Light microscope or digital camera | – | – | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
| Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | – | TissueMiser or alternative models |
| Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
| Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | – | – | follow institutional protocol |
| Paper towels or delicate task wipes | – | – | |
| Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
| Postoperative analgesic | – | – | Institutional protocol |
| Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
| Shaver | – | – | electric clippers, or other |
| Staining jars | – | – | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
| Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
| Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | – | – | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
| Syringes: 5 mL (or greater) | – | – | for sterile filtration of collagenase digestion media |
| Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
| Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | – | – | |
| Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |
Riferimenti
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