Trasplante de células epiteliales de rata mamaria en la almohadilla de grasa blanca interescapular
Summary
Este artículo describe un método de trasplante para injertar células epiteliales mamarias de ratas de donantes en la almohadilla de grasa blanca interescapular de los animales receptores. Este método se puede utilizar para examinar los efectos del huésped y/o del donante en el desarrollo del epitelio mamario y elimina la necesidad de pre-clearing, extendiendo así la utilidad de esta técnica.
Abstract
Ya en la década de 1970, los investigadores han trasplantado con éxito las células epiteliales mamarias a la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas. El injerto de epitelio mamario mediante técnicas de trasplante aprovecha el entorno hormonal proporcionado por el huésped adolescente. Estos estudios son ideales para explorar el impacto de varias manipulaciones biológicas en el desarrollo de la glándula mamaria y diseccionar muchos aspectos de la biología de la glándula mamaria. Una característica común, pero limitante, es que las células epiteliales trasplantadas están fuertemente influenciadas por el estroma circundante y son sube a la competencia por epitelio endógeno; para utilizar tejido mamario nativo, la almohadilla de grasa blanca abdominal-inguinal debe eliminarse para eliminar el epitelio mamario huésped antes del trasplante. Un obstáculo importante cuando se utiliza el organismo modelo de rata es que limpiar el árbol mamario en desarrollo en ratas post-dedianas no es eficiente. Cuando se trasplantan en almohadillas de grasa libres de glándulas, las células epiteliales del donante pueden repoblar la almohadilla de grasa del huésped limpiada y formar una glándula mamaria funcional. La almohadilla de grasa interescapular es un lugar alternativo para estos injertos. Una ventaja importante es que carece de estructuras ductales, pero proporciona el estroma normal que es necesario para promover el crecimiento epitelial y es fácilmente accesible en la rata. Otra ventaja importante de esta técnica es que es mínimamente invasiva, ya que elimina la necesidad de cauterizar y eliminar el creciente árbol mamario endógeno. Además, la almohadilla de grasa interescapular contiene un vaso sanguíneo medial que se puede utilizar para separar sitios para el injerto. Debido a que las glándulas endógenas permanecen intactas, esta técnica también se puede utilizar para estudios que comparan la glándula mamaria endógena con la glándula trasplantada. Este artículo describe el método de trasplante de células epiteliales mamarias en la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas.
Introduction
El desarrollo de la glándula mamaria postnatal y la morfogénesis ductal son procesos influenciados en gran medida por la señalización hormonal al inicio de la pubertad. En ratones y ratas, comúnmente utilizados organismos modelo de la biología de la glándula mamaria, este proceso comienza alrededor de 3 semanas de edad, donde la rápida proliferación y diferenciación resultan en la formación del parénquima maduro. La glándula mamaria madura puede sufrir numerosas rondas de expansión e involución, una propiedad que ha estado siendo investigada desde principios delsiglo XX. En el contexto de la hiperproliferación y el desarrollo del cáncer, las técnicas de trasplante de glándulas mamarias se desarrollaron en la década de 19501,y se mejoraron con la metodología cuantitativa aportada por Gould et al. en 19772,3,4. El refinamiento de la técnica de trasplante en roedores ha contribuido a grandes avances en la comprensión de la biología normal de la glándula mamaria que todavía se utilizan ampliamente para estudiar el efecto de varios tratamientos y la manipulación genética en el desarrollo normal de la glándula mamaria y los estados de enfermedad.
Muchas hipótesis se han generado y probado posteriormente utilizando el trasplante de glándulas mamarias, descrito por primera vez por DeOme et al. en 19591. Los experimentos a lo largo de varias décadas mostraron la propensión del tejido ducal extirpado de las glándulas mamarias del donante a repoblar toda la almohadilla de grasa5,6,7 e indicaron que un componente crítico del desarrollo de la glándula mamaria reside en estas estructuras epiteliales. Estudios posteriores en ratones mostraron que una sola célula madre mamaria puede repoblar una almohadilla de grasa aclarada y contribuyó al descubrimiento de un progenitor único y común de células epiteliales mamarias basales y luminales8,9,10. En línea con estas conclusiones, se ha sugerido que el trasplante aumenta el conjunto de células con potencial de repoblación multilineaje como resultado de la plasticidad, permitiendo que las células injertadas crezcan una glándula mamaria funcional7,10,11,12,13. Es importante destacar que el uso de técnicas de trasplante en roedores supera las limitaciones de las anomalías inducidas por el cultivo celular14 y a menudo proporciona resultados en cuestión de semanas.
Mientras que el procedimiento fue descrito originalmente en el contexto de lesiones preneoplásicas en ratones, pronto se amplió a ratas y se utilizó junto con el tratamiento de carcinógenos para establecer la multiplicidad como una medida de la susceptibilidad al cáncer15,pero la popularidad de las técnicas de trasplante ha seguido el desarrollo de herramientas genéticas para cada especie. Aunque los estudios de ratón que incorporan trasplantes han contribuido con muchos hallazgos traslacionales, el parénquima de la glándula mamaria de la rata se asemeja más al humano más de16,17 y ofrece ventajas distintas para el estudio del cáncer de mama receptor-positivo de estrógeno (ER+). Los tumores mamarios son inducibles en ambas especies, pero difieren en términos de sensibilidad hormonal y perfiles de expresión génica. Una diferencia principal es que los tumores mamarios de ratas expresan y dependen de la función de los receptores de hormonas ováricas y pituitarias, a saber, estrógeno y progesterona (PR), similar al subtipo luminal-A del cáncer de mama humano. De hecho, el trasplante de células epiteliales mamarias, como se describe en este protocolo, se ha utilizado para estudiar las variantes genéticas implicadas en el cáncer de mama y determinar la autonomía celular de los efectos sobre las células epiteliales mamarias18.
Además de la biología tumoral, el epitelio ductal de la glándula mamaria de rata normal presenta un nivel más alto de ramificación y está flanqueado por una capa más gruesa de estroma que el ratón. La importancia del estroma está bien documentada en estudios de trasplante epitelial mamario. El epitelio mamario debe interactuar con el estroma graso, e idealmente su propio mesenquima, para someterse a su característica morfogénesis19,20. El injerto de tejido en una glándula mamaria receptora proporciona un ambiente óptimo; sin embargo, la presencia de epitelio endógeno puede interferir con los resultados. La prelimpieza de la glándula mamaria del epitelio endógeno se realiza comúnmente en ensayos de trasplante de ratón y requiere la escisión quirúrgica del tejido mamario endógeno y/o la extirpación del pezón1,21,22. Aunque es posible, prelimpiar el epitelio mamario en ratas post-destetaderas no es tan ampliamente realizado, principalmente debido a la ineficacia de limpiar el árbol mamario en crecimiento en ratas post-destete. Dado que se ha demostrado que las regiones de tejido adiposo en otras partes del cuerpo podrían apoyar el crecimiento del epitelio mamario trasplantado21,23,24, el proceso de prelimpieza se puede evitar fácilmente en ratas injertando tejido en la almohadilla de grasa blanca interescapular.
El método de trasplante descrito en este documento consiste en la inyección de organoides de la glándula mamaria disociadas enzimáticamente (fragmentos de epitelio ductal mamario y otros tipos de células capaces de morfogénesis) o células monodispersas en la almohadilla de grasa interescapular en cepas endogámicas, isogénicas o congénicas de ratas de laboratorio2. Debido a que la almohadilla de grasa interescapular normalmente está desprovista de tejido mamario, proporciona un entorno adecuado para múltiples sitios de trasplante sin la necesidad de pre-borrar epitelio endógeno. Como resultado, las glándulas mamarias endógenas, de la inguinal abdominal-inguinal del animal huésped no están sujetas a manipulación quirúrgica, se desarrollan normalmente y no pueden interferir con la interpretación de los resultados. Además, las glándulas mamarias intactas se pueden utilizar para la comparación para evaluar los efectos del huésped frente al donante en el desarrollo del epitelio mamario y la tumorigenesis18,25. Aunque la repoblación de la glándula mamaria a partir de una sola célula madre está disponible para ratones, todavía no se ha desarrollado para ratas, principalmente debido a la falta de disponibilidad de anticuerpos para seleccionar para las células madre mamarias de rata25,26,27. A pesar de esto, el trasplante de células epiteliales mamarias monodispersas para cuantificar el potencial de repoblación se puede realizar con éxito, y esas células se desarrollarán normalmente cuando se injerten en el marco apropiado2,3,4. Si bien los organoides son buenos para muchos propósitos, se requieren células monodispersas para aplicaciones cuantitativas, por ejemplo, para determinar el número de células epiteliales mamarias necesarias para la iniciación del cáncer tras el tratamiento de radiación ionizante28 o para comparar las características de las poblaciones de células epiteliales mamarias seleccionadas citométricamente29.
Hasta la fecha, el procedimiento descrito aquí es el método más robusto para realizar el trasplante de glándula sómariaense en la rata con un objetivo general de estudiar el desarrollo de la glándula mamaria y los mecanismos subyacentes al desarrollo del cáncer de mama. A menudo, el donante y/o los animales receptores están expuestos a diferentes variables antes, durante o después del trasplante epitelial. Algunos ejemplos son los estudios de un solo gen que implican carcinogénesis química30,radiación28,31,32,manipulación genética del genoma del huésped/donante18y manipulación hormonal12. Una de las principales ventajas de la disociación enzimática descrita en este protocolo es la oportunidad de aislar organoides epiteliales o células monodispersas para experimentos complementarios que implican citometría de flujo, cultivo 3D, edición de genes y más. Las aplicaciones futuras de esta técnica incluirán la manipulación adicional del donante y/o tejido huésped con ingeniería genética. Por ejemplo, las células del donante pueden ser alteradas genéticamente ex vivo en cualquier locus genómico elegido utilizando el sistema de edición de genes CRISPR-Cas9. Del mismo modo, las ratas receptoras también pueden ser alteradas genéticamente para estudiar la interacción entre los factores genéticos diseñados por donantes y receptores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe una técnica de trasplante de células epiteliales mamarias optimizada para trabajar con ratas. Los organoides epiteliales mamarios aislados de ratas donantes (3-5 semanas de edad) se injertan en la almohadilla de grasa blanca interescapular de ratas receptoras (también de 3 a 5 semanas de edad). Los resultados pueden ser interpretados tan poco como 4-6 semanas más tarde, utilizando microscopía de luz para examinar el tejido injertado; sin embargo, la cantidad óptima de tiempo entre el traspla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Centro Oncológico de Hollings Cancer Center Grant P30 CA138313 fondos piloto de investigación de los Institutos Nacionales de Salud(https://www.nih.gov/),y fondos del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad Médica de Carolina del Sur. Nos gustaría dar las gracias a Marijne Smiths por grabar las declaraciones de la entrevista.
Materials
| 0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
| 1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
| 100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
| 100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
| 1000 uL pipette tips + pipette | – | – | transferring cells/mixtures/tissue |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
| 40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
| 50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
| 60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
| Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
| Anesthesia vaporizer for veterinary use | – | – | follow institutional protocol |
| Beta-dine or iodine | – | – | |
| Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
| Cell counting apparatus | – | – | |
| Clean animal cages for recovery | – | – | follow institutional protocol |
| Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
| deionized water | – | – | for chemical solutions |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
| EDTA | – | – | monodispersion mixture |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | – | inactivation solution |
| Gauze | – | – | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
| HBSS | GIBCO | – | monodispersion mixture |
| Heating pads | – | – | follow institutional protocol |
| Ice buckets (x2) | – | – | |
| Incubator with orbital rotation | – | – | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
| Isoflurane anesthesia | – | – | follow institutional protocol |
| Light microscope or digital camera | – | – | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
| Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | – | TissueMiser or alternative models |
| Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
| Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | – | – | follow institutional protocol |
| Paper towels or delicate task wipes | – | – | |
| Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
| Postoperative analgesic | – | – | Institutional protocol |
| Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
| Shaver | – | – | electric clippers, or other |
| Staining jars | – | – | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
| Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
| Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | – | – | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
| Syringes: 5 mL (or greater) | – | – | for sterile filtration of collagenase digestion media |
| Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
| Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | – | – | |
| Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |
Riferimenti
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