Summary
طول الألياف العصبية داخل بنية ثلاثية الأبعاد لمنطقة الدماغ هو معلمة موثوق بها لتحديد سلامة الخلايا العصبية الهيكلية محددة أو انحطاط. هذه المقالة تفاصيل طريقة القياس الكمي ستيريولوجية لقياس طول الألياف الكوليني داخل نواة basalis Meynert في الفئران كمثال.
Abstract
غالباً ما يرتبط طول المحاور العصبية أو الكولينية الأخرى في مناطق الدماغ المختلفة بالوظيفة المحددة للمنطقة. Stereology هو وسيلة مفيدة لتحديد ملامح الخلايا العصبية من هياكل الدماغ المختلفة. هنا نقدم بروتوكول stereology القائم على البرمجيات لتقدير الطول الإجمالي للألياف الكوليني في نواة basalis من Meynert (NBM) من الدماغ الأمامي القاعدي. تستخدم الطريقة مسبار كرة الفضاء لتقديرات الطول. يتم تصور الألياف الكوليني من قبل أسيتيل ترانسفيز الكولين (ChAT) التلطيخ المناعي مع الفجل بيروكسيديز-ديامينوبنزيدين (HRP-DAB) نظام الكشف. بروتوكول تلطيخ صالح أيضا لتقدير عدد الألياف والخلايا في مختلف مناطق الدماغ باستخدام برنامج stereology. يمكن استخدام بروتوكول الاستريولوجيا لتقدير أي ملامح خطية مثل الألياف الكولينوسيبتيفية ، الألياف الدوبامين / الكاتيوكولامينرجية ، الألياف السيروتونية ، عمليات الخلايا الفلكية ، أو حتى ملامح الأوعية الدموية.
Introduction
التقديرات الكمية لطول و / أو كثافة الألياف العصبية في الدماغ هي معلمات هامة للدراسات العصبية. غالباً ما يرتبط طول الكوليني, الدوبامين, ومحاور عصبية السيروتونية في مناطق الدماغ المختلفة مع وظائف محددة للمنطقة. لأن توزيع هذه المحاور غير متجانسة عموما، ويستخدم الاستريولوجية القائمة على التصميم لتجنب التحيز أثناء أخذ العينات. وقد تم تصميم مسبار كرة الفضاء من stereology لتوفير تدابير فعالة وموثوق بها من الهياكل مثل خط مثل الألياف العصبية في منطقة ذات أهمية1. يجعل المسبار كرة افتراضية يتم فرضها بشكل منهجي في الأنسجة لقياس تقاطعات الخطوط مع سطح المسبار. لأنه من المستحيل وضع تحقيقات الكرة في الأنسجة للتحليل ، فإن البرنامج المتاح تجاريًا يوفر كرة افتراضية ثلاثية الأبعاد (3D) ، وهي في الأساس سلسلة من الدوائر متحدة المركز ذات الأقطار المختلفة التي تمثل سطح مسبار الكرة.
التنكس العصبي الكوليني الانتقائي هو واحد من السمات الثابتة لمرض الزهايمر (AD)2،3،4. ويعتبر انتقال الكوليني المختل ة عاملا مسببا للتدهور المعرفي في AD. الخلل الكوليني هو واضح أيضا في العديد من الاضطرابات النفسية الأخرى مثل باركنسون, الإدمان, وانفصام الشخصية. تتم دراسة جوانب مختلفة من التنكس العصبي الكوليني في النماذج الحيوانية (على سبيل المثال، الحد من أستيل5، بروتين كات6، التنكس العصبي الألياف الكولينية في محيط لويحات اميلويد6، وانخفاض في الألياف الكولينية والدوالي متشابك7،8). ويعتقد أن انحطاط الألياف يحدث في وقت سابق من فقدان الخلايا العصبية, لأن فقدان الخلايا العصبية الكولينية لا لوحظ دائما في الدراسات. معظم الخلايا العصبية الكولينية في الدماغ القاعدي وجذع الدماغ، ومحاورهم المحورية مشروع إلى مناطق مختلفة في الدماغ مثل القشريات والحصين. يقع NBM في الدماغ الأمامي القاعدي ووجد أنه أحد مناطق الدماغ المصابة بشكل شائع في AD.
ويستند أسلوب كسور من stereology على أخذ العينات العشوائية منهجية من الأنسجة على مستويات متعددة. قسم أخذ العينات الكسر (SSF) هو أخذ العينات المنهجية غير المستندة إلى الكمبيوتر من المقاطع لطريقة كسور من stereology. كسر أخذ عينات المنطقة (ASF) هو كسر منطقة من المنطقة ذات الاهتمام في القسم. سمك كسر أخذ العينات (TSF) هو كسور في سمك مقطع. يسمح لنا مسبار كرة الفضاء بتحديد ملامح الاهتمام في كرة ثلاثية الأبعاد في مواقع مجزأة. هنا نستخدم مسبار كرة الفضاء لتقدير الطول الإجمالي للألياف الكوليني في NBM من دماغ الماوس لتوضيح الإجراءات. يوفر البروتوكول الحالي تفاصيل حول معالجة الأنسجة ، وطرق أخذ العينات لعلم الستريولوجيا ، وتلطيخ الهيستوكيميائية المناعية باستخدام الأجسام المضادة ChAT ، والستيريولوجية غير المتحيزة لتقدير طول الألياف الكولينية وكثافة الألياف في NBM من دماغ الماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع إجراءات استخدام هذه الحيوانات من قبل لجنة الرعاية والاستخدام الطبي للمحاربين القدامى في مدينة كانساس سيتي. الفئران البالغة من العمر ثمانية عشر شهرا المبالغة في التعبير عن السويدية متحولة بيتا اميلويد بروتين السلائف (APPswe) وC57/BL6 WT littermates استخدمت للتجارب. وترد تفاصيل التربية والجينية في He et al.8.
1. الترويج ومعالجة الأنسجة
- تحقن الفئران باستخدام حقنة داخل البلاق مع الكيتامين (100 ملغ/كغ) وإكسيلازين (10 ملغ/كغ). قرصة إصبع ان ما يؤكد عدم استجابة قبل الاستمرار9.
- Transcardially perfuse مع ~ 50 مل من الجليد البارد0.1M دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة (DPBS) تليها 4٪ paraformaldehyde (PFA) في 0.1M فوسفات العازلة (PB)10.
تنبيه: PFA سامة. استخدام معدات الحماية الشخصية (PPE) عند العمل مع PFA. - إزالة العقول10 وتزج في 4٪ PFA في 0.1 M PB في 4 درجة مئوية لتثبيت ما بعد التثبيت لمدة 24 ساعة غسل مع DPBS 3x.
- تغيير إلى 15٪ محلول السكروز في 0.1 DPBS بين عشية وضحاها ثم 30٪ محلول السكروز في 0.1 M DPBS لمدة 48 ساعة أخرى عند 4 درجات مئوية.
- إزالة الأنسجة من محلول السكروز وتجميد في غرفة بوتومي مسبقا إلى درجة حرارة -20 درجة مئوية. يمكن تخزين العينات المجمدة في أنابيب مختومة عند -80 درجة مئوية حتى القسمة.
- تضمين الأنسجة في درجة حرارة القطع المثلى تضمين المتوسطة (انظر جدول المواد)وجبل على قرص عينة. قطع المسلسل 30 ميكرومتر أقسام سميكة في طائرة كورونا باستخدام cryotome وجمع جميع الأقسام وبالتالي في 24 لوحات ثقافة جيدة مليئة محلول cryoprotectant (30٪ الجلسرين، 30٪ جلايكول الإيثيلين، 40٪ DPBS؛ الشكل 1A-C). تخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية.
ملاحظة: يُفضل وضع أقسام أكثر سمكاً (على سبيل المثال، 50 ميكرومتر) عندما يكون ذلك ممكناً. تأكد من أن يتم الاحتفاظ المقاطع في ترتيب القطع وجميع الأقسام تماما في cryoprotectant. يمكن استخدام لوحة بئر 96 كبديل للوحات الآبار 24 لجمع المقاطع. - تغطية الآبار مع لوحة السدادة لمنع التبخر والتجفيف. تخزين لوحات في -20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. الأقسام المخزنة في -20 درجة مئوية مستقرة لعدة أشهر لChAT الكيمياء المناعية.
2. اختيار قسم منهجي للسنة الدولية للخدمات الإنسانية
ملاحظة: ينبغي إجراء دراسة تجريبية لمعرفة العدد الإجمالي للأقسام اللازمة لتحقيق معامل مقبول للخطأ (CE). قيمة CE هو تعبير عن المبلغ الإجمالي للخطأ في إجراء أخذ العينات. تمثل القيمة الأدنى الحد الأدنى من الخطأ وتعتبر قيمة CE أقل من 0.1 مقبولة من قبل البرنامج المستخدم هنا (انظر جدول المواد)11.
- حدد الأقسام الأولى والأخيرة لكل دماغ من خلال مقارنة الميزات المورفولوجية مع أطلس دماغ الماوس القياسي مثل فرانكلين وباكسينوس. NBM يبدأ في bregma -0.0mm وينتهي في -1.6 ملم. لذلك، يحتوي حوالي 50 أقسام NBM. العدد الإجمالي للأقسام هو واحد من المعلمات المطلوبة أثناء stereology. أعطى اختيار كلقسم 8 (SSF = 1/8) ما مجموعه 6-7 أقسام للتحليل وأسفر عن CE مقبول لكل من تقدير الحجم وتقدير طول الألياف في دراستنا التجريبية.
- تبدأ عشوائيا مع واحد من الأقسام الثمانية الأولى ومن ثم عينة بشكل منهجي كلقسم 8 حتى المقطع الخلفي الأخير الذي يحتوي على NBM(الشكل 1C).
3- الكيمياء الهيستوكيميائية المناعية
- نقل المقاطع cryopreserved إلى درجة حرارة الغرفة في cryoprotectant ومن ثم 0.1M الفوسفات عازلة (PB) في 6 لوحات بئر.
- غسل 3x في PB.
- احتضان في 0.3٪ H2O2 في الميثانول لمدة 15 دقيقة.
- غسل 3x في تريس العازلة المالحة (TBS).
- احتضان في 0.25٪ تريتون X-100 في TBS لمدة 30 دقيقة.
- كتلة مع 10٪ مصل البقر العادي (NBS) في 0.1٪ تريتون X-100 في TBS لمدة 30 دقيقة.
- احتضان مع تخفيف 1:1،000 من الأجسام المضادة المضادة للماعز المضادة للإنسان ChAT (انظر جدول المواد)في TBS مع 0.1٪ تريتون X-100 و 1٪ NBS لمدة 48 ساعة في 4 درجة مئوية.
- غسل 3x في TBS في درجة حرارة الغرفة. قم بأداء جميع الاحتضان والغسيل في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان مع biotinylated الأبقار المضادة للماعز الأجسام المضادة الثانوية (انظر جدول المواد)لمدة 1 ساعة.
- غسل 3x في TBS.
- احتضان مع مجمع أفيدين-البيوتين-بيروكسيديز (انظر جدول المواد).
- غسل 3x في TBS.
- تطوير باستخدام حل الركيزة الركيزة الركيزة DAB تعزيز (انظر جدول المواد)وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
تنبيه: DAB هو مادة مسرطنة مشتبه بها. وهو سام عن طريق الاتصال والاستنشاق. استخدام معدات الوقاية الشخصية عند العمل مع DAB. - غسل القسم بضع مرات مع الماء المقطر والاحتفاظ بها في درجة الحموضة تريس = 7.6.
- قم بتركيب المقاطع على الشرائح الجيلاتية. يمكن وضع جميع المقاطع من نسيج واحد على نفس الشريحة. الهواء الجاف للأقسام، وتجفيف 2x لمدة 5 دقيقة مع كل 70٪، 90٪، 95٪، و الإيثانول 100٪، ومن ثم مسح الأقسام مع اثنين من 10 دقيقة xylene غسل. Coverslip المقاطع باستخدام وسط تصاعد (انظر جدول المواد).
ملاحظة: وقت معالجة الجفاف والمقاصة يؤثر على سمك المقاطع. لذلك، يجب استخدام نفس الشروط لكافة الأقسام. وفي الدراسة الحالية، كان متوسط قيمة السماكة النهائية 21.11 ± 0.45 ميكرومتر. - إبقاء المقاطع في غطاء الدخان لتجف. المقاطع الجافة جاهزة للاستريولوجيا.
4. Stereology
ملاحظة: راجع جدول المواد للمجهر والبرامج المستخدمة. سيكون هدف الغمر مع فتحة رقمية (NA) > 1.2 مفيدًا ويجب استخدامه إذا لزم الأمر. يجب تجميع الشرائح وفقًا للنمط الجيني أو مجموعة المعالجة وترميزها. يجب أن يتم إجراء التجسيد الكامل لدراسة واحدة من قبل نفس الشخص ويجب أن يكون الشخص الذي يقوم بعلم الاستريولوجية أعمى عن هوية الشرائح الفردية أو المجموعة التي تم فحصها1،12،13.
- فتح دراسة جديدة في البرنامج. (ملف> دراسة جديدة). سيتم فتح مربع حوار'تهيئة الدراسة'. ملء معلومات الدراسة، وذلك باستخدام مستويات متعددة (أساس الكسر)(الشكل 2A).
- انقر نقرًا مزدوجًا على"وحدة التخزين"ضمن المعلمات، والتي ستفتح مربع حوار وحدة التخزين. قم بتسمية ميزة الاهتمام وحدد ' منطقةعد نقطة' التحقيق. انقر فوق التالي.
- انقر نقرا مزدوجا على المعلمة التالية،'طول'.
- توفير اسم الميزة (على سبيل المثال،'L')حدد 'اسفير'التحقيق وانقر فوق التالي.
- بعد ذلك، انقر على مربع الحوار"دراسة التهيئة"،الذي سيفتح مربع"تهيئة الحالة". ملء معلومات الحالة. يجب ترميز المجموعات قبل بدء الدراسة. العدد الإجمالي للأقسام هو عدد الأقسام التي تبدأ من القسم الأول الذي يحتوي على منطقة الاهتمام إلى القسم الأخير الذي يحتوي على مجال الاهتمام (انظر الخطوة 2.1). الفاصل الزمني لأخذ العينات القسم هو ثمانية، لأنه تم اختيار كل قسم8 لتلطيخ المدينة العالمية للخدمات الإنسانية.
- يؤدي النقر فوق التالي إلى فتح مربع الحوار"تهيئة المسبار"،والذي سيقوم تلقائيًا بتعيين أدنى تكبير لاختيار المنطقة وتقدير الحجم. تأكيد الإعدادات والتحقق مما إذا كان يمكن تحديد المنطقة ذات الاهتمام في التكبير المنخفض المحدد. انقر نقرًا مزدوجًا على"الحجم" وملء 50,000 ميكرومتر3 لكل نقطة لكسر حجم المنطقة. انقر فوق "تم".
- تحت الكائن (عالية) التكبير، تعيين الطول في 63x أو 100x. انقر نقرا مزدوجا على'طول'لفتح مربع الحوار طول المجال وتعيين قطر الكرة إلى 10 ميكرومتر. انقر فوق القيام به.
ملاحظة: يجب تحديد منطقة الحراسة استناداً إلى السماكة الفعلية للمقاطع. يجب على المشغل التحقق من سماكة الأقسام في مواقع متعددة لتجنب أي ضرر. إذا لزم الأمر، ضبط سمك منطقة الحراسة على أساس سمك القسم. - تعيين القيم المناسبة لمنطقة الإطار وارتفاع الإطار ومنطقة الحراسة وتباعد الإطار.
ملاحظة: تعتمد هذه القيم على عدم تجانس ملامح الكائن (الألياف) في منطقة الدراسة. مساحة الإطار من 400 ميكرومتر2،وارتفاع الإطار من 10 ميكرومتر، ومنطقة حراسة من 2 ميكرومتر، وتباعد الإطار من 300 ميكرومتر يعطي قيم CE مقبولة لتقدير طول الألياف في NBM. يجب إجراء دراسة تجريبية بهذه القيم قبل التوجه إلى الحالة التالية. - اتبع التعليمات المقدمة من البرنامج بعد كل خطوة. تظهر الإرشادات إما كمربع حوار و/أو في الجزء السفلي من الشاشة.
- إدراج القسم 1.
- عند التكبير المنخفض (5x)، حدد منطقة الاهتمام من خلال جعل حدود عشوائية حول NBM. انقر على الزر التالي في الزاوية اليسرى من نافذة الفيديو. اتبع التعليمات وتأكد من أن جميع النقاط الخضراء موجودة في NBM. يمكن تضمين النقاط أو استبعادها من خلال النقر على النقاط.
ملاحظة: لا توجد حدود محددة تعيين حول NBM. يتم تحديد الاختيار في الغالب من قبل المحقق. يمكن ملاحظة الخلايا العصبية ChAT + الكوليني لـ NBM في الكبسولة الداخلية (ic) وglobus pallidus (GP). في هذا البروتوكول ، يتم تضمين ic مع ChAT + الخلايا العصبية الكولينية وإسقاطاتها (الألياف) وGP كله في NBM(الشكل 1D). - اتبع التعليمات والتغيير إلى 63x لقياسات الألياف في الكسر الحالي. يظهر مربع الحوار'سمك القسم'على الشاشة. تعيين السطح العلوي والسفلي للقسم لقياس السماكة الفعلية للقسم. يجب استخدام حركة محور Z اليدوية. انقر على القيام به.
ملاحظة: إذا لم يكن هناك ألياف في المنطقة، يمكن تخطي الخطوة للانتقال إلى موقع الكسر التالي. - حرك محور Z ببطء من الأعلى إلى الأسفل في ارتفاع الإطار للقسم ووضع علامة على جميع الألياف المتقاطعة على سطح مسبار الكرة الظاهري(الشكل 3). عند الانتهاء، انقر فوق التالي للانتقال إلى الموقع التالي.
- بعد الانتهاء من جميع الكسور ، سيطلب البرنامج إدراج القسم التالي. كرر الخطوات 4.9-4.12 لجميع الأقسام الستة أو السبعة من الأنسجة.
- في النهاية ، سيقوم البرنامج بإنشاء نتيجة للحالة تظهر قيم CE(الشكل 4). إذا كان CE مقبولاً، انتقل إلى الحالة التالية. ملف > حالة جديدة. إذا CE غير مقبول(الشكل 4A)، يوفر البرنامج توصيات لتغيير بعض المعلمات. في كثير من الحالات، تقليل تباعد الإطار يقلل من قيم CE إلى نطاق مقبول(الشكل 4B).
- بعد الانتهاء من جميع الحالات، وتوليد نتائج لكل حالة ومجموعة(ملف > النتائج).
5 - التحليل والإحصاءات
- يوفر البرنامج بيانات لكل عينة وكل مجموعة. يقوم البرنامج نفسه بحساب الكسور مثل SSF و ASF و TSF ، ويوفر الحجم المرجعي الإجمالي (VREF)والطول الإجمالي (L) للألياف في المنطقة المرجعية (في هذه الحالة ، NBM) (الشكل 4B). تصدير البيانات وحفظها أو نسخها إلى البرنامج الإحصائي المفضل بين تحليل المجموعة. ويبين الجدول 1 بيانات النتائج النموذجية للتحليل الإحصائي. تحليل كثافة الألياف (Lv) عن طريق تقسيم إجمالي طول الألياف مع الحجم المرجعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد النتائج التمثيلية في الجدول 1 والشكل 5. المجموعة C، التي تم فك رموزها كمجموعة APPswe (APP)، كان لها طول ألياف أقل بكثير(الشكل 5B)وكثافة طول الألياف(الشكل 5C)مقارنة بنوعها البري (WILD) القمامة. وأظهرت النتائج أنه لم يكن هناك فرق كبير في حجم البنك الوطني الأول بين المجموعتين اللتين تم تحليلها(الشكل 5A).
الشكل 1: توضيح لمعالجة الأنسجة وأخذ العينات المستخدمة في هذه الدراسة. إعداد العينات وأخذ العينات. (أ)تتم إزالة المخيخ ولمبة الشم قبل تصاعد على قرص العينة. (ب)توجيه الدماغ على قرص العينة لقطع القسم. يساعد الشق الطولي الضحل (الذي تم تمييزه بخط) في نصف الكرة الأرضية على تحديد جانب الدماغ في الأقسام. (C)رسم تخطيطي للوحة بئر 24 تظهر الاختيار المنهجي لكل قسم8 من لوحة البئر 24 (التي تحمل علامة 'X'). (D)رسم تخطيطي للأقسام التاجية التي تحدد حدود NBM في الأقسام الستة المختارة بشكل منهجي. (E-G) صور تمثيلية للأقسام التاجية الملطخة بالمناعة لـ ChAT وموقع NBM (موضح). (H)صورة تكبير عالية تظهر حدود NBM. LV = البطين الجانبي; VL = نواة المهاالم البطينية; ic = كبسولة داخلية؛ سباق الجائزة الكبرى = جلوبس بالليدوس؛ CPu = caudate putamen (striatum)؛ NBM = نواة basalis Meynert (ممثلة باسم 'B' في أطلس فرانكلين وباشينوس الماوس). مقياس شريط = 1 ملم(E-G)،200 ميكرومتر(H). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور لقطة شاشة. (أ)'دراسة تهيئة'(ب)'تهيئة الحالة'، و(C)'التحقيق تهيئة'مربعات الحوار. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مسبار اسفير باستخدام قطاع بصري. صور لقطة شاشة تمثيلية تُظهر الطائرات الأربع للكرة ووسم الألياف المتقاطعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية. (A)يظهر CE غير مقبول و(B)يظهر CE مقبول لتقدير الطول. كما يتم عرض ASF و SSF و TSF لكل حالة في النتائج. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: البيانات والتحليلات التمثيلية. تمثيل رسومي للحجم(A)والطول(B)وكثافة الطول(C)في NBM من مجموعتين. تم تحليل البيانات ضمن مجموعتين مختلفتين باستخدام اختبار الطالب t. *ص < 0.05. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مجموعه | حاله # | حجم (μm^3) | الطول (ميكرومتر) | LV (μm/μm^3) |
| ب | 1 | 926885302 | 16446282 | 0.018 |
| ب | 2 | 856582400 | 19254528 | 0.022 |
| ب | 3 | 1150520830 | 15980131 | 0.014 |
| ج | 1 | 981056585 | 12108328 | 0.012 |
| ج | 2 | 894169486 | 6905567 | 0.008 |
| ج | 3 | 998618871 | 10359766 | 0.010 |
| الاحصاءات | ||||
| متوسط المجموعة ب | 977996177.3 | 17226980.33 | 0.018 | |
| مجموعة SD B | 153490036.6 | 1771309.218 | 0.004 | |
| يعني المجموعة جيم | 957948314 | 9791220.333 | 0.010 | |
| SD المجموعة جيم | 55927744.89 | 2647567.494 | 0.002 | |
| TTEST B vs C | 0.84 | 0.02 | 0.049 | |
الجدول 1: البيانات والتحليلات التمثيلية. تم نسخ قيم الحجم والطول مباشرة من النتائج التي يوفرها برنامج stereology. تم حساب كثافة الطول (Lv) بقسمة قيم الطول على قيم وحدة التخزين لكل حالة. تم حساب قيم p باستخدام اختبار t للطالب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نشرح طريقة لتقدير كثافة الألياف الكولينية في NBM باستخدام مسبار كرة الفضاء (الكرة). يقدر هذا المسبار إجمالي طول الألياف في المنطقة ذات الاهتمام. يمكن تقسيم الطول الإجمالي على حجم المنطقة للحصول على كثافة الألياف. ولتقدير حجم المنطقة، استُخدمت طريقة عدد نقاط كافاليري. طريقة عدد نقاط كافالييري هي مقدر غير متحيز وفعال لحجم مرجعي ثلاثي الأبعاد لأي منطقة. تقوم الطريقة بحساب تقدير المساحة على سطح قطع مقطع عن طريق عد النقاط (التي تمثل كسور المنطقة) ثم الضرب بالمسافة بين قسمين تم تحليلهما11. لا تتطلب الطريقة تتبع ًا دقيقًا ومكثفًا للعامل لمحيط المنطقة ذات الاهتمام. يتم استخدامه بالاقتران مع كسور بصرية لتقدير كثافة الخلايا والألياف.
يتطلب التحليل الاستريولوجي طريقة أخذ عينات دقيقة. وينبغي تحديد منطقة الدماغ من الفائدة بشكل صحيح مع تلطيخ. يقع NBM بين AP bregma -0.0 مم إلى -1.6 مم لكل أطلس الماوس فرانكلين وباكسينوس. بالنسبة للكيمياء الهيستوكيميائية المناعية ، يجب اختيار الأقسام بشكل منهجي وعشوائي ، مما يعني أنه يجب اختيار القسم الأول بشكل عشوائي ومن ثم يجب اختيار الأقسام الأخرى بشكل منهجي. بالنسبة لدماغ الفأر البالغ، يتكون NBM من حوالي 1600 ميكرومتر (الأمامي الخلفي)، وهو ما يعني حوالي 53 قسمًا إكليليًا بسماكة 30 ميكرومترًا. ثم، إذا تم تحديد كل قسم8، سيكون هناك 6-7 أقسام مطلوبة لوصمة عار للتحليل الاستريولوجي. في الإجراء المعتاد لدينا، 6-7 أقسام كافية لتقدير العدد الإجمالي للألياف الكولينية في NBM. ويقترح تحليل CE للتحقق في بداية التحسين المنهجي12.
منهجية تلطيخ السليم هو الشرط الأساسي للدراسة. ChAT تلطيخ للألياف الكوليني يمكن أن يكون تحديا، والعديد من الأجسام المضادة وصمة عار بعض الأجزاء الخلوية ولكن ليس عمليات axodendritic البعيد. يرجى الرجوع إلى بروتوكولنا الموصوف سابقا للحصول على التفاصيل ذات الصلة فيما يتعلق بتلطيخ ChAT8.
تتطلب الطريقة بشكل أساسي أقسامًا سميكة لأن المعالجة النسيجية تسبب انكماشًا في الأنسجة. ومن الناحية المثالية ، أقسام أكثر من 20 ميكرون بعد المعالجة ، وسمك النهائي (غالبا أرق من سمك مقطع الأنسجة الأولية) مطلوب لمسبير الكرة الفضائية. لذلك ، يوصى بسماكة مقطع 50 ميكرومتر. الانكماش غير متساو ٍ بشكل عام ، ويمكن أن يؤثر على التشوهات الحجمية داخل الأنسجة وبالتالي يتغير في قيمة Lv. على سبيل المثال ، لوحظ اختلاف متعدد الجوانب في كثافة طول الشعيرات الدموية عندما تم تحليلها في الجسم الحي باستخدام التصوير متعدد الفوتون14،15. وبالنظر إلى هذه المسألة، من الأجدى الإبلاغ عن الطول لكل منطقة بدلاً من الطول لكل مجلد.
على الرغم من أن القيم المعينة في البروتوكول عملت تماما، ينصح دائما دراسة تجريبية لدراسة فردية. بعد الانتهاء من حالة عينة نسيج واحد ، يوفر البرنامج قيمة CE لتصميم أخذ العينات المختار. يتم استخدام قيمة CE لتقدير دقة التقدير ويمكن حسابها بواسطة عدة صيغ. يستخدم البرنامج المستخدم هنا صيغة Gunderson لعام 1999 لتحليل CE ويعتبرها مقبولة إذا كانت القيم أقل من 0.11،16. يجب تعديل مخطط تصميم أخذ العينات حتى تصبح قيمة CE مقبولة قبل تكييف البروتوكول لعينات أخرى. بشكل عام، عدد متزايد من أخذ العينات (عن طريق تقليل الفاصل الزمني الإطار) يقلل من قيمة CE. عمليا لا يوجد هيكل في النظام البيولوجي هو ملف خط مثالي، ولكن شرائط أو اسطوانات. لذلك ، يختلف تحديد ميزة التداخل الدقيق في نقطة التركيز من شخص لآخر. وبالتالي ، ينبغي إجراء التجسيد لجميع عينات دراسة معينة من قبل نفس الشخص. لتجنب التحيز المحتمل، يجب أن يكون مشغل الاختزال أعمى عن معرف العينة.
الاستنساخ هو مصدر قلق كبير في هذه الطريقة. عامل واحد هو انكماش الأنسجة والتشوهات أثناء معالجة العينة التي يمكن التغلب عليها إلى حد ما باستخدام في المجهر confocal الجسم الحي13،14،15. الكرة الفضاء يتطلب تلطيخ التباين العالي ودقة التصوير جيدة لتصور الهياكل. وبما أن الألياف ليست عادة في شكل خطي، فإن تحديد عمليات الاعتراض يبقى في الغالب قرار المشغل. وقد اقتُرح تجزئة تلقائية للسمات النسيجية للتغلب على هذه المشكلة. ومع ذلك، هذا غير متوفر حتى الآن13.
ميزة استخدام الستيريولوجية هو أنه يوفر مخطط غير متحيز لتحليل الهياكل في الأنسجة ثلاثية الأبعاد. يوفر مسبار كرة الفضاء كسورًا متساوية الخواص داخل عينات الأنسجة ، وبالتالي يقدم نهجًا غير متحيز لتحديد طول الألياف. وهناك طريقة بديلة لتحليل كثافة الألياف هو قياس الكثافة البصرية للتلطيخ الهيستوكيميائية. توفر الطرق المستندة إلى كثافة التلطيخ تقديرًا شبه كمي لكثافة التلطيخ وقد تكون أو لا تكون حساسة بما يكفي للتمييز بين تغيرات الخلايا العصبية والألياف الكولينية في NBM. تستخدم الطرق المجسمة باستخدام مسبار كرة الفضاء (الكرة) تحديد الألياف استنادًا إلى خصائصها البصرية وتوفر تقديرًا للطول الحقيقي للألياف. ويمكن أيضا أن يستخدم البروتوكول لتحليل ملامح خطية أخرى في الدماغ، مثل الألياف الكولينية (باستخدام أستيل الكولين esterase histochemistry), الدوبامين أو الألياف الكاتيوكولافيرجية (التيروزين هيدروكسيلاس المناعة), ألياف السيروتونين (السيروتونين المناعة) , هياكل الأوعية الدموية (CD31 التلطيخ المناعي), أو عمليات الخلايا الفلكية (البروتين الحمضي الرجال الدجيلي, GFAP, المناعة17,18,19,20 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح إلى W.Z.S. من دائرة البحث والتطوير الطبي، وإدارة شؤون المحاربين القدامى (مراجعة الجدارة 1I01 BX001067-01A2)، وجمعية الزهايمر (NPSPAD-11-202149)، وموارد من الغرب الأوسط الطبية الحيوية مؤسسة البحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, Pt 1 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. Unbiased Stereology-A Concise Guide. , Johns Hopkins University Press. (2011).
- West, M. J.
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered. Journal of Microscopy. 193, Pt 3 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
