Summary
Neuronale vezel lengte binnen een driedimensionale structuur van een hersengebied is een betrouwbare parameter om specifieke neuronale structurele integriteit of degeneratie te kwantificeren. Dit artikel beschrijft een stereologische kwantificeringsmethode om cholinerge vezellengte binnen de kernbasisvan Meynert bij muizen als voorbeeld te meten.
Abstract
De lengte van cholinerge of andere neuronale axonen in verschillende hersengebieden zijn vaak gecorreleerd met de specifieke functie van de regio. Stereologie is een nuttige methode om neuronale profielen van verschillende hersenstructuren te kwantificeren. Hier bieden we een software-gebaseerde stereologie protocol om de totale lengte van cholinerge vezels in de kern basalis van Meynert (NBM) van de basale voorhersenen schatten. De methode maakt gebruik van een ruimtesonde voor lengteschattingen. De cholinerge vezels worden gevisualiseerd door choline acetyltransferase (ChAT) immunostaining met de mierikswortel peroxidase-diaminobenzidine (HRP-DAB) detectiesysteem. Het kleuringsprotocol is ook geldig voor vezel- en celnummerschatting in verschillende hersengebieden met behulp van stereologiesoftware. Het stereologieprotocol kan worden gebruikt voor de schatting van lineaire profielen zoals cholinoceptieve vezels, dopaminerge/catecholaminere vezels, serotonergic vezels, astrocyteprocessen of zelfs vasculaire profielen.
Introduction
Kwantitatieve schattingen van lengte en/of dichtheid van zenuwvezels in de hersenen zijn belangrijke parameters van neuropathologische studies. De lengte van cholinerge, dopaminerge, en serotonergic axonen in verschillende hersengebieden zijn vaak gecorreleerd met de specifieke functies van de regio. Omdat de verdeling van deze axonen over het algemeen heterogeen is, wordt op het ontwerp gebaseerde stereologie gebruikt om bias tijdens de bemonstering te voorkomen. De ruimtesonde van stereologie is ontworpen om efficiënte en betrouwbare maatregelen van lijn-achtige structuren zoals neuronale vezels in een regio van belang1. De sonde maakt een virtuele bol die systematisch in het weefsel wordt opgelegd om lijnkruisingen met het oppervlak van de sonde te meten. Omdat het onmogelijk is om bolsondes in het weefsel te plaatsen voor analyse, biedt de commercieel beschikbare software een virtuele driedimensionale (3D) bol, wat in feite een reeks concentrische cirkels is van verschillende diameters die het oppervlak van de bolsonde vertegenwoordigen.
Selectieve cholinerge neurodegeneratie is een van de consistente kenmerken van de ziekte van Alzheimer (AD)2,3,4. Disfunctionele cholinerge transmissie wordt beschouwd als een oorzakelijke factor voor cognitieve achteruitgang in AD. Cholinerge disfunctie is ook duidelijk in vele andere psychische stoornissen zoals Parkinson, verslaving, en schizofrenie. Verschillende aspecten van cholinerge neurodegeneratie worden bestudeerd in diermodellen (bijvoorbeeld, vermindering van acetylcholine5, ChAT eiwit6, cholinerge vezel neurodegeneratie in de buurt van amyloïde plaques6, en afname van cholinerge vezels en synaptische spataderen7,8). Vezeldegeneratie wordt verondersteld plaats te vinden eerder dan neuronale verlies, omdat cholinerge neuronale verlies niet altijd wordt waargenomen in studies. De meeste cholinerge neuronen zijn in de basale voorhersenen en de hersenstam, en hun axonen project naar verschillende hersengebieden zoals de cortices en hippocampus. NBM is gelegen in de basale voorhersenen en bleek een van de meest getroffen hersengebieden in AD.
De fractionatormethode van stereologie is gebaseerd op systematische willekeurige bemonstering van een weefsel op meerdere niveaus. Sectiebemonsteringsfractie (SSF) is de niet-computergebaseerde systematische bemonstering van secties voor de fractionatormethode van stereologie. De zonebemonsteringsfractie (AF) is een breuk van een gebied in de regio van belang in de sectie. Dikte bemonstering sfractie (TSF) is de fractionatie van de dikte van een sectie. De ruimtesonde stelt ons in staat om profielen van belang in een 3D-bol te kwantificeren op gefractioneerde locaties. Hier gebruiken we een ruimtesonde voor de schatting van de totale lengte van cholinerge vezels in de NBM van muishersenen om de procedures te illustreren. Het huidige protocol bevat details over weefselverwerking, bemonsteringsmethoden voor stereologie, immunohistochemische kleuring met behulp van het ChAT-antilichaam en onbevooroordeelde stereologie om cholinerge vezellengte en vezeldichtheid in de NBM van de muishersenen te schatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures voor het gebruik van deze dieren zijn goedgekeurd door de Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Achttien maanden oude muizen overexpressing Zweedse mutant beta-amyloïde voorloper eiwit (APPswe) en hun C57/BL6 WT nestmates werden gebruikt voor de experimenten. Details van de fokkerij en genotyping wordt gegeven in He et al.8.
1. Perfusie en weefselverwerking
- Verdovende muizen met behulp van een intraperitoneale injectie met ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg). Knijpen tenen om een gebrek aan reactie te bevestigen alvorens9.
- Transcardially perfuse met ~50 mL ijskoud 0,1 M Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS), gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M fosfaatbuffer (PB)10.
LET OP: PFA is giftig. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE) bij het werken met PFA. - Verwijder hersenen10 en dompel onder in 4% PFA in 0,1 M PB bij 4 °C voor postfixatie gedurende 24 uur. Wassen met DPBS 3x.
- Verander in 0,1 DPBS 's nachts naar 15% sucroseoplossing en vervolgens 30% sacharoseoplossing in 0,1 M DPBS voor nog eens 48 uur bij 4 °C.
- Verwijder het weefsel uit de sacharoseoplossing en vries in een cryotomekamer die vooraf is ingesteld op een temperatuur van -20 °C. Bevroren monsters kunnen worden opgeslagen in verzegelde buizen bij -80 °C tot het delen.
- Sluit weefsels in een optimaal snijtemperatuurinbeddingmedium (zie Tabel met materialen)en monteer op een monsterschijf. Snijd seriële 30 μm dikke secties in een coronaal vlak met behulp van een cryotoom en verzamel alle secties bijgevolg in 24 putkweekplaten gevuld met cryoprotectantoplossing (30% glycerol, 30% ethyleenglycol, 40% DPBS; Figuur 1A–C). Bewaar in een vriezer van -20 °C.
OPMERKING: Dikkere secties (bijvoorbeeld 50 μm) hebben de voorkeur wanneer dat haalbaar is. Zorg ervoor dat de secties in snijvolgorde worden bewaard en alle secties volledig in cryoprotectant zijn. Een 96 putplaat kan worden gebruikt als alternatief voor 24 putplaten om secties te verzamelen. - Bedek de putten met plaatsealer om verdamping en droging te voorkomen. Bewaar platen bij -20 °C tot verder gebruik. Secties opgeslagen bij -20 °C zijn stabiel gedurende enkele maanden voor ChAT immunohistochemie.
2. Systematische sectieselectie voor IHC
OPMERKING: Er moet een proefstudie worden uitgevoerd om te weten hoeveel secties nodig zijn om een aanvaardbare foutcoëfficiënt (CE) te bereiken. De CE-waarde is een uitdrukking van de totale hoeveelheid fouten in de bemonsteringsprocedure. De laagste waarde vertegenwoordigt de minimale fout en een CE-waarde lager dan 0,1 wordt aanvaardbaar geacht door de software die hier wordt gebruikt (zie Tabel met materialen)11.
- Identificeer de eerste en laatste secties voor elk brein door morfologische kenmerken te vergelijken met een standaard muishersenatlas zoals Franklin en Paxinos. NBM begint bij bregma -0,0mm en eindigt bij -1,6 mm. Daarom bevatten ongeveer 50 secties NBM. Het totale aantal secties is een van de parameters die nodig zijn tijdens de stereologie. De selectie van elke8e sectie (SSF = 1/8) gaf een totaal van 6-7 secties voor de analyse en leverde een aanvaardbare CE voor zowel volumeschatting en vezellengte schatting in onze pilot studie.
- Willekeurig beginnen met een van de eerste acht secties en vervolgens systemisch monster om de 8e sectie tot de laatste achterste sectie met NBM (Figuur 1C).
3. Immunohistochemie
- Breng de cryopreserved secties over op kamertemperatuur in cryoprotectant en vervolgens 0,1 M fosfaatbuffer (PB) in 6 putplaten.
- Was 3x in PB.
- Incubeer in 0,3% H2O2 in methanol gedurende 15 min.
- Was 3x in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS).
- Incubeer in 0,25% Triton X-100 in TBS voor 30 min.
- Blok met 10% normaal runderserum (NBS) in 0,1% Triton X-100 in TBS gedurende 30 min.
- Incubeer met een 1:1.000 verdunning van geit anti-menselijke ChAT primaire antilichamen (zie Tabel van Materialen) in TBS met 0,1% Triton X-100 en 1% NBS voor 48 uur bij 4 °C.
- Was 3x in tbs bij kamertemperatuur. Voer alle verdere incubatie en wassen op kamertemperatuur.
- Incubeer met biotinylated runderanti-geit secundair antilichaam (zie Tabel met materialen) voor 1 uur.
- Was 3x in tbs.
- Incubeer met het complex avidin-biotine-peroxidase (zie Tabel met materialen).
- Was 3x in tbs.
- Ontwikkel volgens de aanbevelingen van de fabrikant met behulp van een verbeterde DAB peroxidase substraatoplossing (zie Tabel met materialen).
LET OP: DAB is een vermoedelijke kankerverwekkende stof. Het is giftig door contact en inademing. Gebruik PPE bij het werken met DAB. - Was de sectie een paar keer met gedestilleerd water en bewaar in Tris pH = 7,6.
- Monteer de secties op de gegelatineerde dia's. Alle secties van één weefsel kunnen op dezelfde dia worden geplaatst. Lucht droogt de secties, dehydrateert 2x voor 5 min elk met 70%, 90%, 95%, en 100% ethanol, en dan duidelijk de secties met twee 10 min xyleen wast. Coverslip de secties met behulp van montagemedium (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: De verwerkingstijd van uitdroging en clearing beïnvloedt de dikte van de secties. Daarom moeten voor alle secties dezelfde voorwaarden worden gebruikt. In de huidige studie was de gemiddelde waarde voor de einddikte 21,11 ± 0,45 μm. - Houd de secties in de rookkap te drogen. De droge secties zijn klaar voor stereologie.
4. Stereologie
LET OP: Zie de tabel met materialen voor de gebruikte microscoop en software. Een onderdompelingsdoelstelling met een numeriek diafragma (NA) > 1.2 is nuttig en moet indien nodig worden gebruikt. Dia's moeten worden gegroepeerd op basis van genotype of behandelingsgroep en gecodeerd. De volledige stereologie voor één studie moet door dezelfde persoon worden uitgevoerd en de persoon die de stereologie uitvoert, moet blind zijn voor de identiteit van de afzonderlijke dia's of groep diewordtonderzocht 1,12,13.
- Open een nieuwe studie in de software. (Bestand > Nieuwe studie). Er wordt een dialoogvenster'Studieinitialisatie'geopend. Vul de studie-informatie in met behulp van Multi-level (Fraction Based) (Figuur 2A).
- Dubbelklik op 'Volume'onder Parameters, waarmee het dialoogvenster Volume wordt geopend. Geef de functie van belang een naam en selecteer'Gebiedspunttellen' sonde. Klik op Volgende.
- Dubbelklik op de volgende parameter 'Lengte'.
- Geef een naam van de functie op(bijvoorbeeld 'L') Selecteer 'Sphere'sonde en klik op Volgende.
- Klik vervolgens op het dialoogvenster'Studieinitialisatie'waarmee het vak'Case Initialization'wordt geopend. Vul de gegevens van de aanvraag in. Groepen moeten worden gecodeerd voordat u met de studie begint. Het totale aantal secties is het aantal secties dat begint vanaf het eerste deel met het interessegebied tot het laatste gedeelte met interessegebied (zie stap 2.1). Het sectiebemonsteringsinterval is acht, omdat elke8e sectie werd geselecteerd voor de IHC-kleuring.
- Als u op Volgende klikt, wordt het dialoogvenster'Initialisatie' van de sondegeopend, waarmee automatisch de laagste vergroting voor de regioselectie en volumeschatting wordt ingesteld. Bevestig de instellingen en controleer of het interessegebied kan worden geïdentificeerd bij de geselecteerde lagere vergroting. Dubbelklik op'Volume' en vul 50.000 μm3 per punt voor de volumefractie van de regio. Klik op Gereed.
- Stel onder Object (Hoge) vergroting de lengte in op 63x of 100x. Dubbelklik op'Lengte'om het dialoogvenster Lengtebol te openen en de diameter van de bol in te stellen op 10 μm. Klik op Gereed.
OPMERKING: De wachtzone moet worden bepaald op basis van de werkelijke dikte van de secties. De operator moet de dikte van de secties op meerdere plaatsen controleren om schade te voorkomen. Pas indien nodig de dikte van de wachtzone aan op basis van de dikte van de sectie. - Stel de juiste waarden in voor framegebied, framehoogte, wachtzone en frameafstand.
OPMERKING: Deze waarden zijn afhankelijk van de heterogeniteit van de objectprofielen (vezels) in het studiegebied. Een framegebied van 400 μm2,framehoogte van 10 μm, wachtzone van 2 μm en frameafstand van 300 μm geven aanvaardbare CE-waarden voor schatting van de vezellengte in NBM. Een proefstudie moet met deze waarden worden uitgevoerd voordat naar het volgende geval wordt geleid. - Volg de instructies die door de software na elke stap. De instructies worden weergegeven als een dialoogvenster en/of onder aan het scherm.
- Sectie 1 invoegen.
- Bij lage vergroting (5x), definieer de regio van belang door het maken van een willekeurige grens rond de NBM. Klik op de knop Volgende in de linkerhoek van het videovenster. Volg de instructies en bevestig alle groene punten zijn in de NBM. De punten kunnen worden opgenomen of uitgesloten door op de punten te klikken.
OPMERKING: Er is geen duidelijke, vastgestelde grens rond de NBM. De selectie is meestal door de onderzoeker gedefinieerd. De ChAT+ cholinerge neuronen van de NBM kunnen worden waargenomen in de interne capsule (ic) en globus pallidus (GP). In dit protocol, de ic met ChAT + cholinerge neuronen en hun projecties (vezels) en hele huisarts is opgenomen in de NBM (Figuur 1D). - Volg de instructies en verander in 63x voor vezelmetingen bij de huidige fractie. Het dialoogvensterSectiediktewordt op het scherm weergegeven. Stel het boven- en onderkant van de sectie in om de werkelijke dikte van de sectie te meten. De handmatige Z-asbeweging moet worden gebruikt. Klik op Gereed.
OPMERKING: Als er geen glasvezel in het gebied is, kan de stap worden overgeslagen om naar de volgende fractielocatie te gaan. - Beweeg de Z-as langzaam van boven naar beneden in de framehoogte van de sectie en markeer alle kruisende vezels op het oppervlak van de virtuele bolsonde(figuur 3). Klik op Volgende om naar de volgende locatie te gaan.
- Na het voltooien van alle breuken, zal de software vragen om de volgende sectie in te voegen. Herhaal stap 4.9–4.12 voor alle zes of zeven delen van het weefsel.
- Aan het einde zal de software een resultaat genereren voor de case met de CE-waarden(figuur 4). Als de CE aanvaardbaar is, ga dan naar de volgende zaak. Bestand > Nieuwe aanvraag. Als de CE niet aanvaardbaar is(figuur 4A),geeft de software aanbevelingen om een aantal parameters te wijzigen. In veel gevallen verlaagt het verkleinen van de frameafstand de CE-waarden tot een aanvaardbaar bereik (figuur 4B).
- Nadat u alle aanvragen hebt voltooid, genereert u resultaten voor elke aanvraag en groep(Bestand > Resultaten).
5. Analyse en statistieken
- De software biedt gegevens voor elk monster en elke groep. De software zelf berekent breuken zoals SSF, AsF en TSF en biedt het totale referentievolume (VREF)en de totale lengte (L) van de vezels in het referentiegebied (in dit geval NBM) (figuur 4B). Exporteer de gegevens en sla of kopieer naar de statistische software van keuze voor tussen groepsanalyse. Tabel 1 toont typische resultaatgegevens voor statistische analyse. Analyseer de vezeldichtheid (Lv) door de totale vezellengte te delen met het referentievolume.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten worden weergegeven in tabel 1 en figuur 5. Groep C, dat werd gedecodeerd als APPswe group (APP), had een aanzienlijk lagere vezellengte (figuur 5B) en vezellengtedichtheid(figuur 5C)in vergelijking met hun wilde type (WILD) nestmaatjes. Uit de resultaten bleek dat er geen significant verschil was in het volume van de NBM tussen de twee geanalyseerde groepen (figuur 5A).
Figuur 1: Illustratie van weefselverwerking en -bemonstering die in het onderhavige onderzoek wordt gebruikt. Monstervoorbereiding en bemonstering. (A) De cerebellum en olfactorische lamp worden verwijderd voordat montage op het monster schijf. (B) Oriëntatie van de hersenen op het monster schijf voor sectie snijden. Een ondiepe longitudinale incisie (gemarkeerd met een lijn) op de ene halfrond helpt om de zijkant van de hersenen in de secties te identificeren. (C) Schematisch diagram van een 24-putplaat met de systematische selectie van elke8e sectie uit de 24 putplaat (gemarkeerd als 'X'). (D) Schematisch diagram van coronale secties die de grenzen van NBM in de systematisch geselecteerde zes secties afhouden. (E-G) Representatieve beelden van coronale secties die zijn voor ChAT en locatie van NBM (beschreven). (H) Een hoge vergroting beeld met de NBM grenzen. LV = laterale ventrikel; VL = ventrolaterale thalamische kern; ic = interne capsule; GP = globus pallidus; CPu = caudate putamen (striatum); NBM = nucleus basalis van Meynert (vertegenwoordigd als 'B' in Franklin en Paxinos muizenatlas). Schaalbalk = 1 mm (E-G), 200 μm (H). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Screenshot afbeeldingen. (A) 'Studieinitialisatie' (B) 'Case Initialization', en (C) 'Probe Initialization' dialoogvensters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Bolsonde met behulp van een optische dissector. Representatieve screenshot beelden met de vier vlakken van een bol en het markeren van kruisende vezels. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten. (A) toont een onaanvaardbare CE en (B) toont een aanvaardbare CE voor lengte schatting. De AsF, SSF en TSF voor elk geval wordt ook gepresenteerd in de resultaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Representatieve gegevens en analyse. Grafische weergave van volume (A), lengte (B) en lengtedichtheid(C)in de NBM van twee groepen. De gegevens werden geanalyseerd binnen twee verschillende groepen met behulp van de Student t-test. *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Groep | Geval # | Volume (μm^3) | Lengte (μm) | Lv (μm/μm^3) |
| B | 1 | 926885302 | 16446282 | 0.018 |
| B | 2 | 856582400 | 19254528 | 0.022 |
| B | 3 | 1150520830 | 15980131 | 0.014 |
| C | 1 | 981056585 | 12108328 | 0.012 |
| C | 2 | 894169486 | 6905567 | 0.008 |
| C | 3 | 998618871 | 10359766 | 0.010 |
| Statistieken | ||||
| Gemiddelde groep B | 977996177.3 | 17226980.33 | 0.018 | |
| SD Groep B | 153490036.6 | 1771309.218 | 0.004 | |
| Gemiddelde groep C | 957948314 | 9791220.333 | 0.010 | |
| SD-groep C | 55927744.89 | 2647567.494 | 0.002 | |
| TTEST B vs C | 0.84 | 0.02 | 0.049 | |
Tabel 1: Representatieve gegevens en analyse. Volume- en lengtewaarden werden rechtstreeks gekopieerd uit de resultaten van de stereologiesoftware. Lengtedichtheid (Lv) werd berekend door de lengtewaarden te delen door de volumewaarden van elk geval. p-waarden werden berekend met behulp van de t-test van student.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier demonstreren we een methode om de dichtheid van cholinerge vezels in de NBM te schatten met behulp van een ruimtebal (bol) sonde. Deze sonde schat de totale vezellengte in het gebied van belang. De totale lengte kan worden gedeeld door het volume van de regio om de vezeldichtheid te krijgen. Om het volume van de regio te schatten, werd de Methode van het puntentellingsaantal Cavalieri gebruikt. De Cavalieri-punttellingsmethode is een onpartijdige en efficiënte schatter van een 3D-referentievolume voor elke regio. De methode berekent een schatting van het gebied op een snijoppervlak van een sectie door punten te tellen (die oppervlaktefracties vertegenwoordigen) en vermenigvuldigt zich vervolgens met de afstand tussen twee geanalyseerde secties11. De methode vereist geen arbeidsintensieve, nauwkeurige tracering van de omtrek van de regio van belang. Het wordt gebruikt in combinatie met optische fractionators om de dichtheid van cellen en vezels te schatten.
Stereologische analyse vereist een nauwkeurige bemonsteringsmethode. Het hersengebied van belang moet goed worden gedefinieerd met vlekken. De NBM zit tussen de AP bregma -0,0 mm tot -1,6 mm per de Franklin en Paxinos muisatlas. Voor immunohistochemie moeten secties systematisch, willekeurig worden gekozen, wat betekent dat het eerste deel willekeurig moet worden geselecteerd en dat andere secties systematisch moeten worden gekozen. Voor een volwassen muisbrein bestaat de NBM uit ongeveer 1.600 μm (voorste-achterste), wat ongeveer 53 coronale secties 30 μm dik betekent. Dan, als elke 8e sectie wordt geselecteerd, zullen er 6−7 secties nodig zijn om te vlekken voor stereologische analyse. In onze gebruikelijke procedure, 6−7 secties zijn genoeg voor het schatten van het totale aantal cholinerge vezels in de NBM. Analyse van de CE wordt voorgesteld voor verificatie aan het begin van de methodologische optimalisatie12.
Een goede kleuring methodologie is de basisvereiste voor een studie. ChAT kleuring voor cholinerge vezels kan een uitdaging zijn, en veel antilichamen vlekken sommige van de cellulaire delen, maar niet de verre axodendritic processen. Raadpleeg ons eerder beschreven protocol voor de relevante details met betrekking tot ChAT kleuring8.
De methode vereist in wezen dikke secties omdat histologische verwerking krimp in het weefsel veroorzaakt. Idealiter zijn secties van meer dan 20 μm nabewerking, uiteindelijke dikte (vaak dunner dan de initiële weefselsectiedikte) vereist voor ruimtesondes. Daarom wordt een sectiedikte van 50 μm aanbevolen. De krimp is over het algemeen ongelijk, en het kan invloed hebben op volumetrische vervormingen binnen het weefsel en dus veranderen in Lv waarde. Zo werd een meervoudig verschil waargenomen in capillaire lengtedichtheid toen het in vivo werd geanalyseerd met behulp van multifotonimaging14,15. Gezien dit probleem is het effectiever om de lengte per regio te rapporteren in plaats van de lengte per volume.
Hoewel de gegeven waarden in het protocol perfect werkten, wordt een proefstudie voor een individuele studie altijd geadviseerd. Na het voltooien van een enkel weefsel monster geval, de software biedt een CE-waarde voor de gekozen sampling ontwerp. De CE-waarde wordt gebruikt om de nauwkeurigheid van de schatting te schatten en kan worden berekend door verschillende formules. De software die hier wordt gebruikt maakt gebruik van Gunderson's 1999 formule om de CE te analyseren en acht het aanvaardbaar als de waarden lager zijn dan 0,11,16. Het bemonsteringsontwerpschema moet worden aangepast totdat de CE-waarde aanvaardbaar is voordat het protocol voor andere monsters wordt aangepast. In het algemeen vermindert een toename van het aantal bemonsteringen (door het frameinterval te verminderen) de CE-waarde. Vrijwel geen structuur in het biologische systeem is een ideaal lijnprofiel, maar linten of cilinders. Daarom varieert het bepalen van de exacte kruisende functie op een scherpstelpunt van persoon tot persoon. Zo moet de stereologie van alle monsters van een bepaald onderzoek door dezelfde persoon worden uitgevoerd. Om mogelijke bias te voorkomen, moet de stereologie-operator blind zijn voor de monster-id.
Reproduceerbaarheid is een grote zorg in deze methode. Een factor is de weefselkrimp en misvormingen tijdens de monsterverwerking die tot op zekere hoogte kunnen worden overwonnen door gebruik te maken van in vivo confocale microscopie13,14,15. De ruimtebal vereist een hoog contrast kleuring en een goede beeldresolutie om structuren te visualiseren. Aangezien de vezels gewoonlijk niet in lineaire vorm zijn, blijft de bepaling van onderscheppingen meestal de beslissing van de exploitant. Geautomatiseerde segmentatie van histologische kenmerken is voorgesteld om dit probleem te overwinnen. Dit is echter nog niet beschikbaar13.
Het voordeel van het gebruik van stereologie is dat het een onpartijdig schema biedt om structuren in een 3D-weefsel te analyseren. De ruimtesonde biedt isotrope breuken binnen weefselmonsters en biedt daarom een onbevooroordeelde benadering om de vezellengte te kwantificeren. Een alternatieve methode om de vezeldichtheid te analyseren is het meten van de optische dichtheid van een histochemische kleuring. De kleuring intensiteit gebaseerde methoden bieden semikwantitatieve schatting van de kleurdichtheid en kan al dan niet gevoelig genoeg zijn om de veranderingen van cholinerge neuronen en vezels in de NBM te onderscheiden. Stereologische methoden met behulp van de ruimte bal (bol) sonde maakt gebruik van de bepaling van vezels op basis van hun visuele kenmerken en biedt een schatting van de werkelijke lengte van de vezels. Het protocol kan ook worden gebruikt om andere lineaire profielen in de hersenen te analyseren, zoals cholinoceptive vezels (met behulp van acetyl choline esterase histochemie), dopaminerge of catecholaminere gevezels (tyrosine hydroxylase immunostaining), serotonergic vezels (serotonine immunostaining), vasculaire structuren (CD31 immunostaining), of astrocyt processen (glial fibrillaire zure eiwitten, GFAP, immunostaining)17,18,19,20,21 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies aan W.Z.S. van de Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), de Alzheimer Association (NPSPAD-11-202149), en bronnen uit de Midwest Biomedical Stichting Onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, Pt 1 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. Unbiased Stereology-A Concise Guide. , Johns Hopkins University Press. (2011).
- West, M. J.
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered. Journal of Microscopy. 193, Pt 3 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
